琼脂糖凝胶电泳是最常用的电泳技术之一，操作简单直接，但具有很强的分辨力。琼脂糖凝胶由微观孔隙组成，充当分子筛，根据电荷、大小和形状分离分子。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分析限制性内切酶产生的DNA片段的强有力的分离方法，它是一种方便的分离大小从100 bp到25 kb不等的DNA片段的分析方法。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳可以更有效地分离小于100 bp的DNA片段脉冲场凝胶电泳用于分离大于25kb的DNA片段。琼脂糖凝胶电泳也可用于分离其他带电生物分子，如RNA和蛋白质。
原则
分离介质是由琼脂糖制成的凝胶。琼脂糖是从海藻属中分离出来的石花菜而且Gracilari一个由重复琼脂糖(L-和d -半乳糖)亚基组成。在凝胶化过程中，琼脂糖聚合物以非共价的方式结合并形成一束网络，其孔径大小决定了凝胶的分子筛分性能。一般情况下，琼脂糖浓度越高，孔径越小。
为了使用琼脂糖凝胶电泳分离DNA, DNA被装入预先铸造的凝胶孔中，并施加电流。DNA(和RNA)分子的磷酸主链带负电荷，因此当被置于电场中时，DNA片段会迁移到带正电的阳极。因为DNA有一个统一的质量/电荷比，DNA分子是按大小分开的。
影响DNA迁移的因素
琼脂糖浓度:
DNA分子的流动性与凝胶浓度成反比。高百分比的凝胶更坚固，更容易处理，但分子的流动性和染色将需要更长的时间，因为凝胶的基质更紧密。用于分离染料或DNA片段的最常见琼脂糖凝胶浓度是0.8%．然而，一些实验需要更高百分比的琼脂糖凝胶，如1%或1.5%。
DNA分子的大小
琼脂糖凝胶的筛分特性影响分子迁移的速率。这种分离的发生是因为小分子比大分子更容易通过凝胶的孔隙。如果两个碎片的大小相似或相同，它们就会在凝胶中一起迁移。
DNA构象
不同形式的DNA以不同的速度通过凝胶;DNA分子具有更紧密的形状(例如:质粒)与相同大小的线性DNA片段相比，它们在凝胶中移动得更快。DNA线性片段的迁移速率与其碱基对大小的对数10成反比。这意味着线性片段越小，它在凝胶中的迁移速度就越快。
外加电压
DNA分子的流动性也受到外加电压的影响。在一定范围内，施加的电压越高，样品迁移越快。
过程
琼脂糖凝胶基质的制备
琼脂糖凝胶电泳的核心是卧式凝胶电泳仪。凝胶是将琼脂糖粉溶解在沸腾的缓冲溶液中制成的。
凝胶中琼脂糖的浓度取决于要分离的DNA片段的大小，大多数凝胶在0.5%-2%之间。然后将溶液冷却到大约55°C然后倒进一个铸造盘，用来做模具。铸孔模板(通常称为梳)放置在铸造盘的末端，当凝胶溶液凝固时形成孔。
凝胶凝固后，凝胶被淹没在一个充满缓冲的电泳室中，该电泳室一端包含一个正极(阳极)，另一端包含一个负极(阴极)。缓冲液的体积不应大于电泳室的1/3。最常见的凝胶缓冲液是TAE (40 mM三乙酸酯，1 mM EDTA)和TBE (45 mM三硼酸盐，1 mM EDTA)。
样品制备及加载
通过将样品与负载染料混合来制备电泳样品。凝胶负载染料通常以6倍浓度(0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯氰醇，30%甘油)制成。凝胶电泳中使用的负载染料有三个主要用途:
- 增加样品的密度，使其浸入凝胶中。
- 提供颜色，简化加载过程。
- 染料以标准速度在凝胶中移动，从而可以估计DNA片段移动的距离。
这些样品用干净的微管输送到样品孔中(可变自动微管是首选)。
在此步骤中可向凝胶中加入溴化乙锭，也可在含0.5 μg/ml EtBr的缓冲液中电泳15-30分钟后染色，然后在缓冲液中染色等时间。
应用电流，分离生物分子
直流电(dc)电源连接到电泳仪，并施加电流。样品中的带电分子通过孔壁进入凝胶。分子有净负电荷迁移到正极(阳极)而净带正电的分子迁移到负极(阴极)。缓冲液作为电的导体并控制pH值，这对生物分子的电荷和稳定性很重要。自DNA有很强的阴性电荷在中性pH时，它通过凝胶向正电极在电泳。
蓝紫色染料允许在电泳过程中对样品迁移进行视觉跟踪。运行凝胶，直到染料迁移到适当的距离。
可视化
琼脂糖凝胶必须在电泳后染色。最常用的DNA显影染色剂是溴化乙锭(EtBr)*。琼脂糖凝胶中DNA的替代染色剂包括SYBR金，SYBR绿，结晶紫和甲基蓝。亚甲基蓝和结晶紫的灵敏度较溴化乙锭低。SYBR金和SYBR绿的灵敏度很高，但比EtBr贵。
EtBr的工作原理是以浓度依赖的方式嵌入到DNA分子中。当暴露在短波紫外线光源(透射光源)下时，乙粒分子芳香环中的电子被激活，从而导致电子返回基态时释放能量(光)。这使得我们可以根据任何特定DNA带的强度来估计DNA的数量。
*溴化乙锭是一种可疑的诱变剂和致癌物，因此必须谨慎处理。这是一种危险废物，因此必须根据严格的当地和/或国家指导方针进行处理。含有亚甲基蓝的污渍被认为比溴化乙锭更安全，但仍应小心处理和处置。
确切的大小可以通过绘制DNA标准(DNA阶梯)不同条带的分子量与每个条带所经过的距离的对数来确定分离DNA片段的长度。DNA标准包含预先确定大小的DNA片段的混合物，可以与未知的DNA样本进行比较。
DNA浓度可以通过以下方法估算:
A.在260 nm处取吸光度。
在260 nm处，吸光度(A)为1单位对应的浓度为:
- dsDNA为50 μg/ml
- RNA为40 μg/ml
- 33 μg/ml ssDNA
- 寡核苷酸为20-30µg/ml
虽然这种方法快速且无损，并能提供样品纯度的信息(例如蛋白质或有机污染物的存在)，但只有在浓度至少为1 μg/ml时才能获得可靠的估计值。此外，这种方法不能区分DNA和RNA。
B.溴化乙锭荧光强度:
样本中DNA的含量可以由溴化乙锭的荧光强度估计(溴化乙锭发出的荧光与DNA的数量成正比)。“未知”溶液中的DNA数量可以通过比较其荧光水平与类似大小的已知数量DNA的强度来估计。如果DNA样本被其他化合物污染，这些化合物在紫外线范围内吸收，或者太稀，无法在260 nm处测量，这种方法是有用的。
参考资料及进一步阅读
- 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段。李佩云，John Costumbrado，徐志远，金永勋J Vis Exp. 2012;(62): 3923。
- 琼脂糖凝胶电泳原理与实践:EDVOTEK
- 琼脂糖凝胶电泳:莱斯大学
- 琼脂糖凝胶电泳的DNA -原理，方案和用途:实验室