金-罗丹明荧光染色

金胺-罗丹明荧光染色法，又称“逃学染色法”，用于观察抗酸杆菌(AFB)。Ziehl-Neelsen(热)和(冷)仍在发展中国家广泛使用。美国疾病控制与预防中心建议在主要患者标本中使用荧光染色检测AFB。

分枝杆菌的耐酸性是由于其厚细胞壁由蜡和脂质组成，含有高含量的分枝杆菌酸。

像金胺-罗丹明这样的荧光染料与其中存在的霉菌酸结合并赋予光亮黄色或橙色荧光对绿色背景当用荧光显微镜观察时。它也被用来染色所有抗酸生物，包括孢子虫寄生虫。

原则

荧光染料，金胺-罗丹明，与生物抗酸细胞壁中发现的霉菌酸形成络合物，抗酸酒精脱色。复染色,高锰酸钾,使组织及其碎片不荧光，从而减少伪影的可能性。紫外线照射下的细胞呈现亮黄色或红橙色。

材料

试剂:

• 主要的污点:金胺罗丹明溶液(谨慎:可能致癌物质)
• 脱色剂: 0.5%酸性酒精(5ml HCl在995 ml 70%酒精中)。（谨慎:易燃、腐蚀性)
• 反染色:0.5%高锰酸钾(50毫升0.25克)。（谨慎:腐蚀性)

其他:

1. 幻灯片:只能使用新的、未划伤的、干净的载玻片;使用旧的、划痕的或脏的幻灯片可能会导致错误的结果。
2. 标识符:用石墨笔或金刚石或碳化钨笔在每张幻灯片上正确标记。
3. 滑架
4. 本生灯

过程

1.涂片的准备:

1. 对痰:用一根棍子，将化脓的痰(含任何黄色干酪样物质)转移到载玻片上，做薄涂片。面积约为½× 1英寸(或2厘米见方)建议。用打圈的方式涂抹。晾干。

注意:一定要准备合适厚度的涂片。太厚的污物可能在染色过程中脱落，可能难以脱色。可能存在的抗酸生物可能被遮蔽。太薄的涂片可能没有足够的样品。

任何一种情况——太厚或太薄——都会导致错误的结果，特别是假阴性。这里(图1)中心的涂片厚度合适。将涂片放在新闻印刷品上方约3 - 4英寸处，如果你能阅读印刷品，则涂片厚度合适。

1. 对尿液:对押金进行涂片三个离心机清晨尿沉积物。

让试样风干并热固定。使用电滑片加热器通常是热固定涂片的首选方法。另一种热固定方法是通过干燥的载玻片，面朝上涂抹，通过燃烧器火焰的蓝色锥体涂抹2到3次。

2. 染色法

• 将固定涂片放在染色架上，用滑片冲洗罗丹明-金胺15分钟．不要让表面干燥。（注意:用于抗酸染色的氟色素包括金胺O，以及金胺O与另一种氟色素罗丹明B的组合)。
• 用蒸馏水把污迹洗掉。
• 荧光幻灯片脱色剂(即酸-醇)为2 - 3分钟．
• 冲洗彻底用蒸馏水。
• 洪水滑坡高锰酸钾3-4分钟．不要让玻片变干。
• 冲洗彻底与蒸馏水然后风干。
• 在与荧光显微镜使用相同的光源下进行显微镜检查(即K530激发滤光片和BG 12阻挡滤光片或G-365激发滤光片和LP 420阻挡滤光片)。玻片可以在高功率(400X)下进行筛选，并在油浸下进行验证。

结果及解释

• 积极的测试-抗酸生物在深色背景下发出红橙色荧光。
• 负面的测试-非抗酸生物不会发出荧光或可能呈现淡黄色，与明亮的抗酸生物截然不同。

要检查的字段数量:

在报告涂片为抗酸微生物阴性之前检查的最少区域数。

最终放大倍率(物镜放大倍率乘以目镜放大倍率)Vs.幻灯片数量

1. 200 x: 30
2. 250 x: 30
3. 400 x: 55
4. 450 x: 70

举报污点

• 如发现荧光AFB，报告涂片为空军基地积极,并以加号(+到+++)表示出现杆菌的数量。
• 如未见荧光棒，报告涂片为没有空军基地。

优势

1. 快速筛选与污点相比锌-涂片可以快速检查使用40 x客观或25 x客观．这增加了检测到AFB的机会，特别是当它们很少的时候。
2. 灵敏度比ZN高~10%。
3. 不需要使用油浸泡。
4. 染色不需要加热。

荧光染色的局限性

1. 需要一个荧光显微镜，这可能很容易得到，也很昂贵(发展中国家限制)
2. 阳性染色反应提供了分枝杆菌存在的推定证据。阴性染色反应并不意味着标本的培养结果为阴性。因此,必须采用培养方法。
3. 像金-罗丹明这样的试剂可能的致癌物质，酸-酒精和高锰酸钾也是一种强烈的刺激性皮肤、眼睛和呼吸系统。使用这类试剂处理和染色时必须小心。
4. 大多数快速生长的菌株可能不会出现荧光。
5. 建议所有阴性荧光涂片Ziehl-Neelsen染色证实；在报告为阴性之前，至少应该检查100个字段。
6. 过度暴露对反染色可能会导致失去光彩荧光生物。
7. 染色涂片应在染色后24小时内观察，因为荧光可能会褪色。

下载
幻灯片演示”荧光染色法检测耐酸分枝杆菌疾控中心
注:以上图片大部分转载自疾控中心PPT幻灯片。