采用Ziehl-Neelsen (ZN)抗酸染色技术进行染色分枝杆菌物种,包括结核分枝杆菌,溃疡菌，麻风菌，而且非结核分枝杆菌(NTM)．在染色和酸洗后的涂片镜检中检测抗酸杆菌(AFB)可提供临床标本中分枝杆菌存在的初步细菌学证据。涂片镜检是最快最简单的方法。
分枝杆菌的细胞壁含有高脂浓度，使其蜡状，疏水，不渗透常规染色，如革兰氏染色。它们还耐酸和酒精，并被描述为抗酸杆菌(AFB)或酸性酒精快杆菌(AAFB)。
抗酸染色常用的方法有两种:
- 碳酚红素法包括Ziehl-Neelsen法和Kinyoun法(光/亮场显微镜)
- 使用金胺- o或金胺-罗丹明染料的荧光染色法
(荧光显微镜)。
齐尔-尼尔森原理抗酸染色方法
用革兰氏染色法不能很好染色的分枝杆菌用革兰氏染色法染色与苯酚化合的Carbol fuchsin．
- 在'热的ZN技术，苯酚-苯酚-品红染色加热，使染料穿透蜡状分枝杆菌细胞壁。
- 在'冷这种技术被称为Kinyoun方法，不加热污渍，但通过增加碱性品红和苯酚的浓度并加入“润湿剂”化学物质来实现渗透。
染色剂与分枝杆菌细胞壁中的分枝杆菌酸结合。染色后，应用酸性脱色溶液。这将红色染料从背景细胞、组织纤维和涂片中的任何生物体中去除，除了保留(附着)染料的分枝杆菌，因此被称为抗酸杆菌(AFB)。
脱色后，痰涂片用孔雀石绿或亚甲蓝进行反染色，使背景材料染色，形成对比颜色，可见红色AFB。
在分枝杆菌物种,结核分枝杆菌而且溃疡分枝杆菌具有很强的抗酸性。当为这些物种的标本染色时，a3% v/v酸性酒精是用来脱色涂片的，而麻风杆菌只是弱抗酸。因此采用0.5-1% v/v脱色溶液麻风杆菌涂片和不同的染色和脱色时间。
注意:0.5%酸性酒精或5%硫酸用于非典型AFB，因为它们(如。麻风杆菌,诺卡氏菌属的小行星)的酸性和酒精含量远低于结核分枝杆菌。
样品采集与制备
由于夜间的分泌物积累，第一个早晨的标本更有可能产生更好的AFB恢复。
- 直接涂片:在处理前直接从患者标本中制备的涂片。
- 间接涂片:由离心处理后的样品制备的涂片(用于浓缩材料)
试剂要求:
- Carbol fuchsin染色(过滤)
- 酸酒精3% v/v(或20%硫酸)
- 孔雀石绿5g/l (0.5% w/v)或亚甲基蓝5g/l
Ziehl-Neelsen染色
所需时间:45分钟。
抗酸杆菌染色程序
- 准备痰涂片
用连续的旋转运动将痰液均匀地涂抹在载玻片的中心区域。涂片的推荐尺寸约为20mm × 10mm。
- 将载玻片放在干燥机上，表面朝上，风干约30分钟。
- 热固定干燥涂抹。
未经处理的标本热固定可能不会致死结核分枝杆菌(处理载玻片时要注意运动)而酒精固定是杀菌的。
- 初次染色的应用
在涂片上涂上一层胭脂红染色剂
- 加热涂片，直到蒸汽开始上升(即大约60度)°C)。
不要过热(煮沸或干燥)。如有必要，可添加额外的染色剂。让受热的污渍留在载玻片上5分钟。
- 用清水把污迹洗掉。
- 脱色剂的应用
将涂片用3% v/v酸性酒精2-5分钟(或20%硫酸)或直至涂片充分脱色，即淡粉色。检查一下，当滑梯倾斜时，没有更多的红色从表面流出。对于非常厚的幻灯片或那些继续“流出”红色染料的幻灯片，添加更多的脱色剂。
- 用清水洗净
- 对比染色
用…盖住污渍孔雀石绿染色1-2分钟．
- 用清水把污迹洗掉
- 将载玻片背面擦拭干净，并将其放在排水架中进行涂抹，使其风干(不要用螺栓干燥)。
在显微镜下检查涂片，使用100倍油浸物镜(10倍目镜，共1000倍放大倍率)，系统扫描涂片。
程序说明:
- 酸性酒精是易燃的;因此，请谨慎使用。
- 在加热硫化赭石时要非常小心(因为染色架可能含有挥发性化学物质)，以减少火灾风险。
- 当放置在染色架上时，载玻片不能相互接触，以防止材料转移
从一张幻灯片到另一张幻灯片。
抗酸染色结果
| 试剂 | 酸快速 | Non-Acid快 |
| Carbol fuchsin与热 | 红色(亮粉色) | 红色(亮粉色) |
| 酸醇 | 红色的 | 无色 |
| 亚甲基蓝/孔雀石绿 | 红色的 | 蓝色/绿色 |
- 空军基地:红色的，直的，或微弯曲的杆，单独或小群出现，可能出现珠状。
- 细胞:绿色
- 背景材质:绿色
痰涂片分级结核分枝杆菌
痰涂片分为少量、1+、2+和3+。
- 当检查300个区域后未见AFB时，报告涂片为“未见AFB”。
- 如果观察到的AFB很少，即在检查100块田地后只观察到1或2个AFB，则要求进一步检查样本(AFB可能来自自来水(腐生分枝杆菌)，也可能是玻片划伤或在干燥时使用同一张吸墨纸。
- 如发现任何红色杆菌，应将涂片报告为“AFB阳性”，并按以下方式注明细菌数目(数量越大，病人的传染性就越大）.
| 观察 | 分级 |
| 观察了300多个油田，没有发现空军基地 | 未见空军基地 |
| 1-9 AFB/100场 | 报告准确数字 |
| 10-99 AFB/ 100场 | 报告为1+ |
| 至少在50个场地中有1-10个AFB/field | 报告为2 + |
| 至少在20个油田中有10个以上的AFB/field | 报告为3+ |
优势
- 痰涂片镜检简单、廉价，可快速检测出传染性肺结核病例;
- 肺结核患者的痰标本——尤其是那些患有空腔病的患者——通常含有足够多的抗酸杆菌，便于用显微镜检测。
AFB显微镜的局限性
- 不区分活的和死的生物
- 接受治疗患者的随访标本可能涂片阳性，但培养阴性
- 显微镜检查抗酸杆菌(AFB)不能区分药物敏感菌株和耐药菌株。
- 有限的敏感性
- 细菌负荷高5000 - 10000 AFB /mL为检测所需(相反，培养阳性菌需要10至100个)。
- 肺外结核、hiv合并感染和非结核分枝杆菌(NTM)所致疾病患者涂片敏感性进一步降低。
- 许多结核病患者的AFB涂片呈阴性，随后的培养呈阳性。
阴性涂片不能排除结核病。
- 有限的特异性
- 所有的分枝杆菌都是抗酸的
- 没有提供物种鉴定
- 结核分枝杆菌的本地流行情况特种加工确定结核分枝杆菌涂片阳性的预测值
抗酸生物列表
- 结核分枝杆菌
- 麻风杆菌(弱抗酸的)
- 其他分枝杆菌
- 诺卡氏菌属spp:部分抗酸
- 红球菌属spp:部分抗酸
- 军团菌micdadei:在组织中部分抗酸
- 囊肿的隐孢子虫:抗酸的
- 囊肿的等孢子球虫属:抗酸的
次氯酸钠离心浓缩AFB工艺
采用次氯酸钠离心技术浓缩痰中存在的AFB，因为它增加了痰涂片检测AFB的机会。次氯酸钠(NaOCl)被推荐用于液化痰液，因为它会致死结核分枝杆菌使实验室技术人员可以安全地处理标本。
过程
- 将1-2毫升痰液化脓性部分(即含有任何干酪样物质)转移到螺帽万能瓶或其他10-20毫升容量的容器中。
- 加入等量的浓缩次氯酸钠(漂白剂)溶液，混合均匀。
- 在室温下放置10-15分钟，每隔一段时间摇晃一下，以分解痰中的粘液。
- 加入约8毫升蒸馏水，混合均匀。
- 3000g离心15分钟。当不可能离心时，将naocl处理过的痰过夜沉淀。
- 用玻璃杯取出并丢弃上清液巴斯德或塑料球吸管．混合沉淀物。
- 滴一滴混合均匀的沉淀物到干净无刮擦的载玻片上，将沉淀物铺成薄的制剂，然后风干。
- 加热修复污迹，用Ziehl-Neelsen技术,在显微镜下观察。
