丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·格拉姆在1884年发明了革兰氏染色法。革兰氏染色程序使用四种化学品;水晶紫，碘，酒精和藏红花，用来染色细菌
革兰氏染色仍然是细菌鉴定和分类的基石。这种差异染色技术根据细胞壁组成将大多数细菌分为两组。
- 革兰氏阳性细菌,污渍紫色
- 革兰氏阴性细菌,污渍红色/粉色
几乎所有临床重要的细菌都可以使用革兰氏染色技术进行可视化，唯一的例外是那些生物体;
目录
革兰氏染色步骤
经典的革兰氏染色技术包括以188金宝搏百度贴吧下步骤:
- 临床资料固定在显微镜载玻片表面加热或使用甲醇。(推荐甲醇固定，而不是热固定。甲醇固定能保持宿主细胞和细菌的形态。加热载玻片会导致细胞变形，增加细胞碎片，并可能导致错误的革兰氏染色结果。
- 初级染料(结晶紫)的应用。水晶紫是一种深蓝色到紫色的染料。它将所有细胞染成蓝色/紫色。
- 媒染剂的应用:加入碘溶液(媒染剂)形成结晶紫碘(CV-I)复合物;所有的单元格继续呈现蓝色。
- 脱色步骤:脱色步骤区分革兰氏阳性和革兰氏阴性细胞。有机溶剂如丙酮或乙醇从富含脂质、薄壁革兰氏阴性菌中提取蓝色染料复合物的程度大于从缺乏脂质、厚壁革兰氏阳性菌中提取的程度。革兰氏阴性菌呈无色，革兰氏阳性菌呈蓝色。
- 反染剂(藏红花素)应用:红色染料藏红花将脱色的革兰氏阴性细胞染成红色/粉红色;革兰氏阳性细菌保持蓝色。
查找信息并处理革兰氏染色试剂的制备
革兰氏染色原理
革兰氏阳性和革兰氏阴性菌细胞壁组成的差异是革兰氏染色差异的原因。革兰氏阳性细胞壁含有一层厚的肽聚糖与大量磷磷酸交联，不易脱色。
在水溶液中，结晶紫解离成CV+和Cl -离子，可穿透革兰氏阳性和革兰氏阴性细胞壁。CV+与细菌细胞的负电荷相互作用，将细胞染成紫色。当添加碘(I-或I3-)时，碘与CV+相互作用，在细胞质和细胞外层内形成大晶体紫碘(CV-I)复合物。
脱色剂(乙醇或乙醇和丙酮溶液)与革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌膜的脂质相互作用。
- 革兰氏阴性细胞的外膜从细胞中脱落，留下薄的肽聚糖层暴露在外。用乙醇处理，革兰氏阴性细胞壁开始渗漏，允许大的CV-I复合物从细胞中被洗掉。
- 高度交联的和多层次的肽聚糖革兰氏阳性细胞的脱水通过加入乙醇。因此，乙醇处理将大型CV-I复合物困在细胞内。
脱色后革兰氏阳性细胞保持紫色。相比之下，革兰氏阴性细胞失去紫色，只有当反染色，正电荷染料显示番红精，则添加。
涂片的准备
- 取一个干净无油的载玻片。
- 将样品(如痰液、脑脊液或脓液)的一个环转移到显微镜载玻片上。如果对菌落进行革兰氏染色，首先放一滴或几圈水，将菌落乳化在水滴中。
- 将样品平铺在一个直径15毫米的圆上的均匀薄膜上。
- 风干样品，一旦样品风干，通过一个热固定涂抹本生灯三次。热敷有助于细胞粘附(固定)在玻片上，并防止其在冲洗过程中丢失。
在涂抹污渍之前，让玻片冷却。或者，涂片可以用甲醇固定。
甲醇固定
将载玻片放置或放在纸巾上，用无水甲醇浸泡载玻片两分钟。或者，将玻片浸入一个装满甲醇的科普林瓶中。
两分钟过后，倾斜载玻片，沥干多余的甲醇，让载玻片自然风干。不要擦拭或吸干载玻片，因为这样会去除细胞。
如果你很难记住这个过程中使用的染色试剂和它们的顺序你可以记住这句话C渗出性中耳炎我n一个nd年代Tain "即命令是Crystal紫罗兰,我odine,一个酒精/丙酮，最后一个是年代afranin。
革兰氏染色法
革兰氏染色程序包括四个主要步骤;用结晶紫染色，固定染料，使用脱色剂，反染色。
- 用结晶紫染色剂将细胞浸湿风干，热固定涂抹1分钟。请注意涂片的质量(细胞浓度过高或过轻)会影响革兰氏染色结果。
- 用温和的自来水冲洗滑梯2秒。
- 用媒染剂淹没滑坡:克氏碘。等待1分钟。
- 用温和的自来水冲洗滑梯2秒。
- 泛滑脱色剂(丙酮醇脱色剂)。等待10-15秒或一滴一滴地加入幻灯片，直到从幻灯片上流出的脱色剂是透明的。
- 用藏红花染色剂冲洗幻灯片。等待30秒~ 1分钟。
- 用自来水冲洗滑块，直到流出物没有颜色为止．
- 将滑梯倾斜在纸巾上或水槽上，让滑梯自然风干。或者，用不起毛的吸水纸吸干幻灯片。请不要使用擦拭动作，因为它可以去除污迹。
- 载玻片现在可以在显微镜下观察了。首先，用标记为40x的高干物镜对焦图像。然后，不拆下滑片，切换到标有100x的高倍油浸物镜。使用浸渍油，观察染色过程的结果油浸下(100x)使用一个亮场显微镜。这将导致整体放大1000倍。
在进行革兰氏染色后技术员应首先确定革兰氏染色是否充分。在适当染色的生物标本中，中性粒细胞的细胞核是红色的。如果细胞核呈蓝色，说明脱色不足。
结果
- 革兰氏阴性细菌会染成粉红色/红色和
- 革兰氏阳性细菌会染成蓝色或紫色。
报告革兰氏涂片
报告应包括下列资料:
- 细菌数量:存在的细菌数量，多、中、少或少
- 革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌的革兰氏反应
- 细菌的形态，无论是球菌、双球菌、链球菌、杆状菌还是球菌。此外，生物体是否在细胞内。
- 脓细胞的存在和数量
- 酵母细胞和上皮细胞的存在。
例子
尿道涂片报告可能写着:“中等数量的革兰氏阴性胞内双球菌和许多脓液细胞。”
限制
革兰氏染色的敏感性较低。有时，你可能无法在革兰氏染色涂片中看到生物体，但相同的临床标本在培养时可能产生生物体。为了在载玻片上可见，用革兰氏染色法染色的生物体必须在大约10分钟内出现4到105每毫升离心液中的微生物数量。
螺旋体和分枝杆菌不建议使用革兰氏染色技术。分枝杆菌染色弱用革兰氏染色，细菌如支原体，Rickettsiae，衣原体不占用革兰氏染色所用的染料，或在光学显微镜下太小而看不见。
并不是所有的细菌都能在革兰氏染色中被发现。这是医学上不可用革兰氏染色法检测的重要细菌清单。
| 的名字 | 原因 | 另一种微观方法 |
| 衣原体,包括c . trachomatis | 细胞内;非常小的 | 细胞质中的包涵体 |
| 嗜肺性军团菌 | 红色反染剂吸收不良 | 延长反染色时间 |
| 支原体瞭解 | 红色反染剂吸收不良 | 没有一个 |
| 分枝杆菌,包括结核分枝杆菌 | 细胞壁中脂质过多，染料无法穿透 | 抗酸的污点 |
| Rickettsiae | 细胞内;非常小的 | 染色或其他组织污渍 |
| 梅毒螺旋体 | 瘦得看不见 | 暗视野显微镜或者荧光抗体 |
质量控制
经常检查新批次的染色剂和试剂，使用含有已知革兰氏阳性和革兰氏阴性微生物的涂片进行正确的染色反应。
革兰氏反应的变化
革兰氏染色结果受多种因素影响。有时结果可能与你预期的完全不同。
- 革兰氏阳性细菌可能失去保留结晶紫和革兰氏阴性染色的能力，原因如下:
- 抗生素治疗或涂片过度热固定导致细菌细胞壁损伤。
- 涂片过度脱色
- 使用黄色而不是棕色的旧碘溶液(始终储存在棕色玻璃或其他不透明的轻质容器中)。
- 旧文化的涂片制备。
- 厚涂片比薄涂片需要更多脱色。当涂片太厚时，革兰氏阴性菌可能在脱色步骤中不能完全脱色，而表现为革兰氏阳性菌。
解读革兰氏斑点的陷阱
| 生物 | 经典演讲 | 变量表示 | 评论 |
| Streptococccus肺炎 | 革兰氏阳性，刺状，双球菌 | 拉长的球菌，类似短杆菌 | 可能被误解为混合生物;过度脱色的细胞可能被误认为是革兰氏阴性球菌。 |
| 不动杆菌仕达屋优先计划． | 革兰氏阴性coccobacilli | 革兰氏阴性球菌;革兰氏可变染色是常见的 | 可能被误认为奈瑟氏菌属属革兰氏阴性球菌;在涂片中寻找一些表现出细长形态的生物，这在奈瑟菌中是看不到的。 |
| perfringens梭状芽胞杆菌 | 箱形革兰氏阳性杆菌 | 革兰氏阳性球菌 | 可能被误认为链球菌引起的肺炎并报告为革兰氏阳性球菌;除了球菌的形式，细胞在脱色过程中顽强地保持结晶紫。 |
| perfringens梭状芽胞杆菌 | Boxcar-shaped革兰氏阳性杆菌 | 革兰氏变菌或革兰氏阴性杆菌 | 可能被误认为是革兰氏阴性杆菌;车厢形状表明这种生物是革兰氏阳性菌;其他梭状芽胞杆菌而且芽孢杆菌也可能出现类似的情况。 |
| 酵母,尤其是新型隐球菌 | 革兰氏阳性圆形或卵形细胞，有出芽 | Gram-variable细胞 | 可能被误认为是文物;大小和形状使它们区别于细菌。 |
参考资料及进一步阅读
