胆汁溶解度试验:原理，程序，结果

胆汁(脱氧胆酸钠)溶解度试验鉴别链球菌引起的肺炎从所有其他溶血性链球菌。链球菌引起的肺炎是胆汁溶性的，而所有其他α -溶血性链球菌是胆汁耐药的。脱氧胆酸钠(水中2%)会溶解肺炎球菌细胞壁。

自溶素的肺炎链球菌负责琼脂培养基上较老的肺炎球菌菌落的中心凹陷或脐状特征。这样的殖民地也被称为绘图员殖民地。

原则

胆盐，特别是脱氧胆酸钠和牛磺胆酸钠，可以溶解链球菌引起的肺炎选择性添加到琼脂或肉汤培养基中活跃生长的细菌中。

胆汁溶解度测试的确切机制尚不完全清楚。胆盐可以降低中膜界面的表面张力。在这些条件下，肺炎链球菌特别容易受到酶的作用或化学制剂的破坏。也加入了胆盐激活自体溶血素(自溶酶肺炎链球菌)，并加速培养肺炎球菌的自然裂解反应。

可进行胆溶性试验要么用肉汤培养，要么用琼脂培养菌落媒体。如果该生物是可溶的，则添加胆盐可明显清除肉汤悬浮液的浑浊。在琼脂培养基上，当滴入试剂时，胆溶性菌落溶解。由于脱氧胆酸钠可能在pH值为6.5或更低的情况下沉淀，因此必须将肉汤培养基调整为pH值7.0以防止假阴性反应。

介质和试剂

1. 在Todd-Hewitt肉汤(或同等物)中，在35°C下生长18-24小时的测试生物体的纯培养物
2. 羊血琼脂板
3. 脱氧胆酸钠(试管试验10%，平板试验2%)
4. 酚红溶液(1%水溶液)
5. 氢氧化钠(NaOH)溶液，0.10 N

试剂制备:

2%和10%脱氧胆酸钠(胆盐)溶液的制备:

• 将2克和10克脱氧胆酸钠分别溶于100毫升无菌蒸馏水中
• 少量使用以减少污染。保质期是270天。
• 保存在15至30°C。在低温下储存试剂会使其变厚。

测试生物

1. 任何α -溶血，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性球菌链具有特征性的中心凹陷(中心扁平)或粘液菌落形态提示肺炎链球菌
2. 从阳性血液培养中得到的任意一对长矛状的革兰氏阳性球菌。
   培养分离物在培养基上进行18-24小时的测试血琼脂板(BAP)在35-37°C和~5%的二氧化碳(或在一个蜡烛瓶)。

质量控制

1. 在使用每一批新的脱氧胆酸钠试剂之前，用已知的阳性和阴性对照进行测试。
2. 如果胆汁试剂不透明且呈淡琥珀色，请勿使用。
3. 生物
   1. 肺炎链球菌ATCC 49619阳性(胆溶性)
   2. 粪肠球菌ATCC 29212阴性(胆汁不溶性)
   3. 链球菌炎ATCC 49456-阴性(胆汁不溶性)。

过程

平板斑点试验

1. 将一滴10%的胆汁溶解度试剂放置在羊血琼脂上生长的18至24小时的疑似菌落附近。倾斜盘子，轻轻将药水滚过几个有代表性的菌落。小心别把殖民地赶出去。
2. 在35°C至37°C的垂直位置有氧孵育板，并定期检查长达30分钟。让盖子微微半开，以加强试剂的蒸发。
3. 观察菌落的崩解或溶解性。

管测试

1. 将隔夜血琼脂板上的细菌生长物添加到1.0 ml 0.85%生理盐水中，使浊度达到0.5-1.0麦克法兰标准范围。
2. 将细胞悬液分成两管(每管0.5 ml)。
3. 在一管中加入0.5毫升2%脱氧胆酸钠(胆盐)。在另一管中加入0.5毫升0.85%的生理盐水。将每根管子混合均匀。
4. 在35-37°C的CO2中培养试管。
5. 使管子旋转。
6. 10分钟后观察管子是否有浊度清除。如果10分钟后呈阴性，继续在35-37°C的CO2中孵育试管长达2小时。再次观察是否清除。控制悬挂应该保持浑浊。

结果

A:现场测试

1. 积极的测试:30分钟内菌落解体和/或在菌落所在的平板上出现α-溶血带。
2. 负面测试:培养皿上的菌落在30分钟内保持完整，菌落完整性没有变化。

B:试管测试

1. 阳性测试:3小时内测试悬浮液清净或失去浊度。控制悬挂仍然浑浊。
2. 阴性测试:测试和控制悬浮液在3小时后仍然浑浊。

报告结果

• 如果现场或试管试验显示一个来自过氧化氢酶阴性，长矛形革兰氏阳性球菌的α溶血菌落的胆汁溶解度，明确报告为链球菌引起的肺炎．
• 如果生物体不是胆溶性的，它很可能是绿藻群链球菌或仍然可能是肺炎链球菌；需要从典型的肺炎球菌菌落中进一步检测。类似的胆汁不溶性菌落肺炎链球菌是否应使用另一种方法进一步识别，如奥普托欣易感性和/或DNA探针和/或基质辅助激光解吸电离飞行时间光谱(MALDI-TOF)。

胆汁溶解度测试中的常见问题:

部分清除(部分溶解度)不被认为是阳性的肺炎球菌鉴定。光chin抑制带小于14毫米的部分可溶性菌株不被认为是肺炎球菌。

助记符:记住这个句子"链球菌pnuemoniae是老板”即。链球菌引起的肺炎是

1. 一个lpha溶血性

2. Bi勒年代oluble

3. Optochin年代ensitive

限制

1. 胆汁溶解度测试仅适用于α-溶血性链球菌。
2. 只有85%的肺炎球菌菌株会在胆汁溶解性测试中完全溶解;其他肺炎链球菌在存在胆汁时不会溶解，可能是由于毒力因子或胶囊的丢失。如果裂解不存在，分离物可能仍然存在肺炎链球菌还需要进一步的测试。
3. 在进行斑点测试时，保持平板水平，以防止试剂流动，这可能会导致一些非肺炎球菌菌落被冲走，导致假阴性测试。
4. 超过24小时的菌落可能失去了它们的活性酶，导致假阴性测试。

参考文献和进一步阅读

1. 科尼曼的彩色地图集和诊断微生物学教科书(查看最新版本)
2. 临床微生物程序手册，第四版。(2016)。美国微生物学会。