文化媒体制备最佳实践

培养基是诊断微生物学的基础。几乎所有的培养基都是现成的琼脂板或肉汤。高收入国家的实验室从专业制造商采购现成的培养基。

培养基可以按照制造商的建议，通过在蒸馏水或去离子水中溶解指定数量的脱水培养基粉末来内部制备。低收入和中等收入国家的实验室更喜欢使用培养基粉制备所需的琼脂和肉汤，而不是购买现成的培养基。

内部文化媒体准备有其固有的挑战，所以这篇博客试图通过汇编媒体准备的最佳实践来解决这个问题。

人工制备培养基是劳动密集型的，因此许多公司开发了自动化培养基制备系统。如果您的实验室有能力购买，自动化培养基制备系统可以节省您的人力和时间。

阅读更多：自动培养基制备和分发系统。

媒体类型和制造商的选择

在选择培养基时，请选择由贵国国家参考实验室支持的信誉良好的制造商生产的产品。仔细检查产品名称、成分、使用说明和保质期。寻找防潮包装(螺旋盖，剥离密封)。

所有细菌学实验室都可能需要少量的基本营养培养基(如营养琼脂或胰蛋白酶大豆琼脂)、强化培养基(如血液琼脂和巧克力琼脂)以及革兰氏阳性菌(Columbia CNA琼脂)和革兰氏阴性菌(MacConkey琼脂)的选择性培养基。

有大量类似应用的媒体。根据环境的不同，您可能需要储备一些用于流行病防范的介质(例如，霍乱风险环境中的TCBS)。从临床微生物学家那里获得帮助，为您的实验室选择合适的培养基。

采购，储存和库存管理

确保您的供应商(主要和备用)是可靠的，并提供售后支持。负责货物的接收，检查和记录;

1. 产品名称和批号
2. 收到的数量
3. 有效期和剩余保质期
4. 包的完整性
5. 订单处理时间
6. 订单交付的正确性

在任何时候，都要遵循制造商关于储存条件的说明。例如，生长补充剂如蛋黄或抗生素溶液应储存在2-8°C，而基础培养基可储存在室温下，不超过30°C。

脱水介质存放在阴凉干燥处，避免光照和灰尘。监控存储区域的温度和湿度。不要将脱水介质存放在蒸汽消毒、煮沸材料、清洗玻璃器皿等的同一房间内。

按照先进先出的系统组织库存，按逻辑顺序排列介质，并将打开和关闭的容器分开。

脱水粉的保质期通常是几年。然而，脱水介质是吸湿(即，它吸收水分)，并迅速恶化时，暴露在潮湿。当接触到水分时，会形成一种坚硬的物质，从而改变介质的化学和微生物特性。这对于气候潮湿的热带国家来说是一个严重的问题。

因此,在容器上记录开封日期，并在开封后最多使用6个月除非制造商另有规定。在此期间之后，需要进行视觉和性能检查。不使用时，保持容器密闭，并用胶带密封瓶盖。

过期、粉末结块、变色、流动不畅或出现质量问题时丢弃;记录产品细节和丢弃原因。

培养基制备

材料/设备的要求

1. 耐热烧瓶(锥形烧瓶)至少是批次大小的两倍
2. 磁力搅拌棒
3. 铝箔
4. 秤
5. 脱水培养基
6. 抹刀
7. 量筒
8. 蒸馏水或去离子水
9. 热板搅拌器
10. 高压灭菌器
11. 无菌培养皿,
12. 红外非接触式温度计

计算及称重

脱水介质应在无湿环境(低湿度)下计算和称重，最好在一个实验室通风柜．确保工作台、天平、物料清洁、无尘、无粉。

平衡

上装式(精密)天平适用于称重介质。将天平放置在水平、稳定、无振动的桌子上。定期校准天平(例如，每年)，并在使用前验证控制重量。

材料和个人防护用品

为防止吸入脱水介质的细颗粒，在处理脱水介质时应佩戴防尘口罩。佩戴手套，避免皮肤接触。在使用含有可能引起皮肤和眼睛刺激成分的介质时，戴上安全护目镜(例如脱氧胆酸钠)(阅读产品说明)。使用脱水培养基工作前后要洗手。

计算

遵循制造商的说明。为固定数量的盘子准备一个有预先定义的重量和体积的桌子。要在直径为9厘米的培养皿中制备深度为4毫米的固体培养基，需要20-25毫升的体积。在日志中记录产品名称、批号、配制日期、水的重量和体积以及操作人员身份。

重

为了便于称量，请使用预先设定体积的材料。打开容器，取适量粉末。立即关闭容器以防受潮。不要把多余的粉末放回瓶子里。

与水混合加热

沸腾通常需要溶解介质粉末，但应严格遵守印刷在介质包装插入页上的特定制造商的说明。使用通过蒸馏、去离子或反渗透制备的淡水。铜离子的存在，高导电性和高pH值可能会显著改变内部制备的介质的质量。不要使用自来水，因为它会影响选择性和pH值。

用于浇注介质的玻璃器皿的质量也是一个重要因素。使用Erlenmeyers，瓶子和由硼硅酸盐玻璃制成的刻度圆筒来测量水，并与介质粉末混合。如果使用可重复使用的玻璃器皿，应只使用硼硅酸盐玻璃器皿，因为苏打玻璃会将碱浸到介质中，改变介质的pH值，可能会影响生长。

将粉末溶解在水中的程序

1. 向烧瓶中倒入一半所需的水，并加入预先称好的粉末。将水预热至50-60°C可促进溶解。
2. 搅拌或旋转几分钟(不要摇晃!)
3. 将剩余的水倒向两侧，溶解粘在烧瓶壁上的任何多余粉末(干粉不能在高压灭菌器中灭菌)
4. 溶解含琼脂的介质需要加热。不要把烧瓶关得太紧。
5. 加热至沸腾，不断搅拌，直到溶液变清。
6. 避免沸腾、过热和起泡、烧焦和燃烧、结块和混合不一致。

灭菌

大多数培养基都需要消毒，所以只有来自病人标本的细菌才会生长，而不是来自水或粉状培养基的污染物。有些介质不能高压灭菌(例如:SS琼脂，Cary Blair琼脂)

液体介质在灭菌前被分配到单独的管或瓶中。只有当成分完全溶解时，才用高压灭菌器灭菌。不要完全拧紧盖子或盖子。琼脂培养基在放入高压釜之前，在大烧瓶或瓶子中消毒，瓶盖上塑料螺旋盖或塞。

时机高压蒸汽灭菌应从温度达到121℃时开始，通常至少需要15分钟。

一次灭菌批次的培养基体积应尽量小;理想情况下，一次只能蒸两升。灭菌指标如鲍威-迪克试验和生物指标如孢子芽孢杆菌stearothermophilus应该用来监控一个正常工作的高压蒸汽。

一旦灭菌周期完成，熔融琼脂冷却至约50°C，然后分配到各个培养皿(每盘约20至25毫升的熔融琼脂)。

避免

• 过度灭菌导致沉淀，pH值变化，成分破坏
• 灭菌不足导致介质被污染

确保

• 包装允许蒸汽渗透
• 物品之间有足够的空间使蒸汽流通
• 使用指示胶带在烧瓶上标记(中号/代码、制备日期、首字母)以识别已灭菌的物品。
• 在每个循环中使用化学指示剂(例如，时间-蒸汽-温度条)，并在间隔的基础上使用生物指示剂来验证高压灭菌器循环。

请注意

• 使用“冷却程序”或等到压力下降到足够低的时候再打开(70-80°C)，以避免压力快速下降(液体可能会沸腾，盖子可能会被吹掉)。
• 不要等待太长时间才卸载高压灭菌器;过热会破坏介质成分。

微调(补充剂和pH值)

如果要添加其他成分(例如，补充如羊血或特定的维生素、营养素、生长促进剂或抗生素)，它们应该在熔融琼脂冷却后，即分发到盘子之前加入。

血液的质量在含血培养基的性能中起着重要的作用，例如，绵羊含血培养基中溶血反应很明显。在用于培养基制备前，应检查血液的浓度、均匀性、粘度和颜色。其他添加剂应考虑分析证明和无菌条件。

不能承受高压灭菌蒸汽灭菌的精细介质组分(如血清、某些碳水化合物溶液、某些抗生素和其他热不稳定物质)应单独用灭菌器消毒膜过滤。溶液通过直径为0.2至0.45 um的膜过滤器不能去除病毒，但可以有效去除大多数细菌和真菌污染物。

配制培养基

在分配之前，在水浴(45-50°C)或热板搅拌器中冷却培养基，以减少凝结。你可以用红外线非接触式温度计检查温度。点胶温度过高会导致过度蒸发。如果介质在水浴中停留太长时间，可能会导致沉淀(重新加热，但不要过热)。不要用冷水冷却琼脂培养基，因为它可能导致薄片或云的形成。

如果使用可重复使用的玻璃培养皿，请在160°C的室温下消毒2小时热风炉．将烤箱冷却至50°C后再打开(以避免玻璃器皿破裂)。在无通风的房间(关闭窗户)无菌地分发介质，避免风扇或气候控制。在靠近火焰的地方工作生物安全柜

在平板中分配琼脂介质的程序

1. 在倒瓶前和倒瓶之间对烧瓶颈进行火焰消毒
2. 在分配之前，通过旋转烧瓶轻轻混合培养基
3. 涂于水平表面
4. 用于抗菌药敏试验，琼脂深度应为4±0.5 mm: 90 mm圆形培养皿:约25 mL
5. 使用无菌，刻度移液器或介质分配注射器/泵
6. 避免形成气泡(火焰表面或使用加热循环移除它们)。

在试管中分配琼脂或液体介质

1. 使用有通风盖的管子(如螺旋盖)，不要完全拧紧。
2. 把管子放在高压灭菌架上。
3. 在分配之前，轻轻旋转烧瓶混合
4. 每管配发正确的容积。使用无菌的，分级的吸量管或者一个介质分配注射器/泵
5. 高压灭菌后，拧紧螺旋盖

板材干燥/管

1. 在室温下干燥几个小时(最多24小时)以去除冷凝物。
2. 选择介质:半盖±30分钟。如有污染风险:请关闭盖子。
3. 包装前要晾干，防止盖子上结露。避免过度干燥(裂缝)。
4. 干燥取决于介质的类型:
   1. 对于倾斜的琼脂，在倾斜的位置晾干，得到2.5-3厘米深，2-2.5厘米长。使用标准化和验证的机架。
   2. 对于琼脂、半固体管和液体介质:在架子上晾干(垂直放置)。

包装和储存

用名称(缩写/代码)、制备日期和批号标记每个盘子。把盘子用密封的、有标签的塑料袋包起来，每袋最多10个盘子，以防受潮。把它们倒扣起来，放在2-8英寸处°C，在黑暗中按照制造商的说明。

保质期

培养皿中的琼脂培养基。

• 血琼脂:7天;添加不稳定添加剂:2-5天
• 最选择性介质:5-7天
• 无血营养琼脂:2-4周

在管

• 简单的，非选择性的肉汤和琼脂:6个月
• 选择性介质:3周(2-8周)
• 亚硒酸盐汤:2-3个月

质量控制

最后，所有培养基，无论是购买的还是制备的，在用于诊断环境之前都必须经过严格的质量控制。质量控制(QC)应基于务实的、基于风险的方法。新配制和分配的培养基应进行隔离，直到通过质检。阅读更多文化媒介的质量控制。

利用文化媒介

使用前将培养基调至室温。确保琼脂表面或杯盖内没有可见的水滴。如果看到，不要抖掉盖子上的冷凝水。

相反，在35-37°C下，琼脂板倒置，琼脂底座以一定角度放置在盖子上，将平板在35-37°C下晾干20-30分钟(如有必要，在20-25°C下晾干过夜)。

不要过度干燥板材(表面有裂缝，表面起皱)。

使用前必须进行目视无菌检查。检查盘子是否有污染或菌落生长。

使用过的培养基的处置

对于使用过的培养基的处置，应遵循国内指南或世卫组织指南，该指南建议在处置前失活并随后焚烧。灭活(所谓的“破坏”或III级灭活)应在实验室中进行，最好采用高压灭菌法。

最常见错误及可能原因

脱水培养基结块

• 储存时湿度过高
• 容器打开时间过长或打开后没有盖紧
• 超过保质期的脱水培养基

错误的pH值

• pH计未校准
• 在太热的介质上进行pH值验证(通常在25°C)
• 使用劣质水或容器
• 使用受化学污染的容器介质不完全溶解/混合
• 脱水介质储存不正确(例如，没有严密关闭)或超过保质期

不完整的溶解度

• 用水不足
• 加热不足/溶解时机不足
• 浸泡不足或混合不完全
• 烧瓶太小，不能充分混合和/或对流

变暗,焦糖化

• 过热:灭菌过度，混合介质在50℃保持时间过长，反复重熔或温度过高。
• 介质溶解不完全

不完整的凝胶或软琼脂

• 产品与水的比例不正确:称量错误或稀释过度
• 琼脂未适当溶解:混合不良，在50°C下延长储存时间
• 培养基过热，可能在低pH值
• 反复的再融化会导致过热

浊度、降水

• 脱水介质质量差
• 使用劣质水或容器
• 过热:灭菌过度，混合介质在50℃保持时间过长，反复重熔或温度过高。
• 错误的pH值
• 介质不完全溶解/混合
• 所制备的培养基由于蒸发而损失的水分

生长不良或性状差异的丧失

• 使用了不正确或维护不当的QC生物
• 过热:过度灭菌，非均匀混合介质保持在50°C过长时间，反复
• 重新熔化或温度过高
• 介质不完全溶解/混合
• 水、容器或接种物中的抑制物质PH值错误

参考文献和进一步阅读

1. 贝利和斯科特的诊断微生物学，福布斯，第11版
2. Orekan J, Barbé B, Oeng S, Ronat JB, Letchford J, Jacobs J, Affolabi D, Hardy L.低收入和中等收入国家临床细菌学培养基:挑战、制备的最佳实践和改善获取的建议。临床微生物感染。2021年10月;27(10):1400-1408。doi: 10.1016 / j.cmi.2021.05.016。Epub 2021 5月18日。PMID: 34015533。