DNA测序-桑格测序法

DNA(脱氧核糖核酸)测序是识别核苷酸精确序列的过程:腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)在基因组或DNA分子。为了确定序列，最早的DNA测序方法是“链终止法”，或桑格测序由弗雷德里克·桑格于1997年开发，使用放射性标记的部分消化碎片。这使得弗雷德里克·桑格和他的团队能够对phiX174病毒的第一个完整基因组进行测序。

桑格测序是一种测序方法，其中链终止寡核苷酸被纳入作为引物在体外DNA复制．[２]

单链DNA分子，DNA聚合酶，四种脱氧核糖核酸三磷酸(dNTPs;dATP, dCTP, dGTP, dTTP)和二脱氧核糖核苷酸三磷酸(ddNTPs;用各种荧光标记物标记的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP)是测序必不可少的成分。

桑格测序原理

桑格测序方法通过添加用不同荧光标记标记的终止延伸的脱氧核苷酸三磷酸和二脱氧核苷酸三磷酸来合成与单链DNA模板互补的DNA。基于这些标签，序列被识别出来。

测序组成部分

DNA模板

测序的起始材料是待测序的单链DNA模板。在传统的方法中，单链DNA是通过载体或碱法或煮沸法使双链DNA变性获得的。然而，现在，单链是由聚合酶链式反应法．

底漆

引物是一种短的寡核苷酸，与短序列的DNA模板互补，并与之退火。将要测序的模板分子的区域是引物所起的关键作用。

DNA聚合酶

它扩展引物并在模板上添加核苷酸互补。该聚合酶缺乏外切酶活性，因为它可能从5ʹ- 3ʹ或3ʹ- 5ʹ中降解核苷酸，并影响确定序列的准确性。

三磷酸核苷酸:这种方法使用两种不同类型的核苷酸:三磷酸脱氧核糖核苷酸和三磷酸二脱氧核糖核苷酸。

1. 脱氧核苷酸三磷酸腺苷:这些是典型的三磷酸核苷酸，包括含氮碱基(A, T, G, C)，分别在3ʹ碳上有羟基的核糖，在5ʹ碳上有磷酸基团，这有助于在每个脱氧核糖三磷酸核苷酸之间形成磷酸二酯键。
2. Dideoxyribonucleotide三磷酸腺苷:这些都是经过修饰的三磷酸核苷酸使得核糖的3ʹ碳没有羟基。因此，这些被用作3ʹ端链终止子，因为磷酸二酯键不会与下一个进入的核苷酸形成。

桑格测序涉及的步骤

伸长率和链终止:

除了三磷酸二脱氧核苷酸外，待测序的DNA模板进行聚合酶链反应(PCR)。dNTPs、DNA聚合酶、引物和模板都在典型的PCR反应中。

引物退火到模板DNA上，DNA聚合酶通过随机添加dnntp或ddNTP来扩展引物，但一旦加入ddNTP，反应就会终止。这些脱氧核苷酸比双脱氧核苷酸大，因此终止不会发生在引物区域附近。例如，如果dATP在延伸过程中绑定，它将停止延伸，并将序列读取为A(如下所示)。同样，如果添加了ddGTP、ddTTP或ddCTP，则依次读取为G、T或C。

传统的方法执行这些反应四支装有典型PCR混合物的试管。尽管如此，每个试管都包括放射性标记的三磷酸二脱氧核苷酸(ddATP, ddCTP, ddTTP或ddGTP)。

另一方面，现在，所有这些反应都是在一个有ddntp的管子里进行的，每个管子都用不同的荧光染料标记。

电泳和序列鉴定:

放大之后，电泳被执行。将混合物装入聚丙烯酰胺凝胶中(传统方法)或装入毛细管凝胶系统管中。这些分子根据它们的长度被分开;每一个末端都含有二脱氧核苷酸。

在传统方法中，产品通过聚丙烯酰胺凝胶(凝胶电泳)，并根据分子质量进行评分，如下图所示。根据它们的质量和放射性标记的ddntp，可以确定碱基。它们的序列如下图左侧所示。鉴定是在仪器的帮助下完成的，分光光度计．

在这项新技术中，这些产物在一个充满聚合物的玻璃毛细管中分离，并通过荧光检测器，根据附着在双脱氧核苷酸上的标签确定每个分子是否以a、T、G或C结尾。

Sanger测序的优势

与其他测序方法相比，Sanger测序有很多优势，主要体现在:

• 它对于测试同一家族的变体更有针对性。
• 广泛的验证是不需要的，因为该方法是在一个或少量感兴趣的序列上验证的。
• 减少对计算工具的依赖。
• 单样本的成本效益。

Sanger测序的局限性

虽然Sanger测序是较好的DNA测序方法，但它也有一定的局限性，主要有以下几点:

• 它只对大约300-1kb碱基的DNA短片段进行测序。
• 不能同时检测不同的基因。
• 它需要大量的DNA作为输入。
• 由于引物与前15 - 40个碱基结合，该区域的序列质量通常较差。
• 这是一种耗时的方法。
• 如果使用传统方法，克隆的载体序列可能出现在最终的序列中。

参考文献

1. 布朗，(2010)。基因克隆与DNA分析导论．约翰·威利父子有限公司出版。
2. Clark, d.p.， Pazdernik, n.j.， & McGehee, m.r.(2010)。在金宝搏beat亚洲体育真人荷官分子生物学:学术细胞更新(第三，第241-242页)。论文，学术出版社/爱思唯尔。
3. Janitz, M.(2008)。下一代基因组测序．WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA
4. https://the-dna-universe.com/2020/11/02/a-journey-through-the-history-of-dna-sequencing/
5. 时间轴:基因组学的历史。@你的基因组·科学网站。https://www.yourgenome.org/facts/timeline-history-of-genomics/
6. https://www.news-medical.net/life-sciences/Challenges-with-Sanger-Sequencing.aspx
7. https://www.mlo-online.com/home/article/13009097/back-to-basics-sanger-sequencing-and的应用