实时PCR也称为定量PCR (qPCR)，是标准PCR的一种变体聚合酶链反应在这种方法中，目标DNA的扩增和同时定量是在同一台PCR机器中完成的，使用的是商用荧光检测热循环仪。荧光染料专门标记感兴趣的DNA，产生的荧光量与DNA的数量成正比。
虽然实时荧光定量PCR的模型多种多样，但它们都有共同的特点:一个标准的热循环平台，加上一个激发源(通常是激光或钨丝灯)，一个用于荧光检测的摄像机，以及用于数据处理的计算机和软件。
根据可用的激发源和检测过滤器，各种荧光染料可用于qPCR。两种最常用的实时PCR方法分别是SYBR绿(一种能与双链DNA结合而不与单链DNA结合的染料，当与单链DNA结合时，会发出荧光)和TaqMan探针。
实时PCR的一些基本特征是:
- 扩增和产物检测均在一个反应容器从未打开过。这大大降低了样品与放大产物交叉污染的机会。
- 与传统的PCR分析相比，实时PCR仪器不仅能够测量扩增产物(扩增子)，而且还能够定量产物的数量，从而确定目标在原始标本中的拷贝数。
- 与传统的基于PCR的检测相比，完成实时PCR检测所需的时间显著减少，因为荧光探针的使用消除了扩增产物的PCR后检测所需的时间。此外，一些系统能够根据仪器设计进行快速热循环，在短短20至30分钟内检测到产品。
一般来说，从提取的核酸放入热循环仪开始扩增到后续产物检测，常规PCR检测至少需要4 - 6小时。
原则
实时PCR与传统的基于PCR的检测方法相同(双链DNA变性，引物退火和延伸)。然而，实时PCR与传统PCR的区别在于检测过程。在实时PCR分析中，扩增子的积累被监测，因为它是使用荧光染料标记引物产生的。这些标签在与扩增子直接相互作用或杂交后产生荧光信号的变化，由仪器测量。该信号与每个周期中扩增产物的数量有关，并随着特定扩增子数量的增加而增加。
目前，一系列荧光化学试剂被用于扩增子检测;比较常用的化学方法可分为两类:(1)涉及荧光染料(例如SYBER Green I)与双链DNA的非特异性结合的化学方法和(2)与感兴趣的目标特异性结合的荧光探针。
检测方法
许多实时PCR方法已经被描述，但有两种已经成为最受欢迎的。
SYBR PCR
SYBR绿是一种能与双链DNA结合而不与单链DNA结合的染料，当这种结合时，会发出荧光。在PCR循环中，随着产生越来越多的SYBR绿色染料附着的双链产物并发出荧光，产生的荧光信号也越来越多。在任何特定时间，反应中的荧光量与反应中双链DNA分子的数量直接相关。
但是，SYBR绿的缺点是它会结合并荧光反应中的所有双链产物，无论是特异性产物、非特异性产物、引物二聚体还是其他扩增产物。
TaqMan探针是以流行的电子游戏《吃豆人》(Taq polymerase + PacMan = TaqMan)命名的，因为作者注意到Taqpolymerase的外切酶活性与经典的《吃豆人》游戏有相似之处。
TaqMan PCR(5 '核酸酶测定)
TaqMan PCR使用与目标DNA内部片段互补的染料标记核酸探针。该染料标记探针退火到靠近两个PCR引物之一的模板链的下游。探针上有两个标记荧光半个,记者(荧光团)附加到探针的5 '端和冷却器与它的3 '末端。
(图片来源:Ref-2)
当报告器和猝灭器连接时，猝灭器通过a吸收能量，从而降低报告染料的荧光信号荧光共振能量转移(FRET)。然而，在PCR过程中，Taq聚合酶，延伸探针目标链上的引物，位移和退化退火探针通过其5 '到3 '外切酶的作用。的荧光团从而从其分子附着的淬火剂和迅速膨胀。
随着PCR产物的增多，更多的染料标记探针会找到目标区域进行连接，最终在随后的扩增过程中释放报告分子。报告染料的释放反映为荧光信号强度的增加，这与合成的扩增子的量成正比。
无论是使用SYBR绿色探针还是TaqMan探针，实时PCR反应中信号强度与模板量之间的关系为定量核酸和检测特定基因序列的存在与否提供了可靠的手段。
应用程序
实时PCR可以计算起始模板浓度，是一种常用的分析工具，用于评估DNA拷贝数、病毒载量、SNP检测和等位基因辨别。在进行逆转录PCR之前，qPCR是测量mRNA表达的有力工具，是检测mRNA表达的金标准微阵列基因表达数据确认。
优势
重要的优势实时聚合酶链反应包括
- 它能够在大范围内测量DNA浓度，
- 其灵敏度高，
- 它能够同时处理多个样品并提供即时信息。
一个缺点这种机器比传统的PCR机器更贵。
参考资料及进一步阅读
- 艾莉亚，M.，谢吉尔，I. S.，威廉森，M.，戈默索尔，L.，艾莉亚，N.和帕特尔，H. R. H.(2005)。实时定量PCR的基本原理。分子诊断专家评论，5(2)，209-219。
- 约翰·m·巴特勒(2012):DNA定量。法医DNA分型的高级专题:方法学。
- 李志刚、李志刚、李志刚(1996)。一种实时定量RT-PCR的新方法。基因组研究，6,995-1001。
- 霍兰德，1991。利用水生热鲈DNA聚合酶5 ' ->3 '外切酶活性检测特异性聚合酶链反应产物。