逆转录酶(RT)- pcr:原理，应用-微生物在线

逆转录酶PCR (RT-PCR)是一种变异聚合酶链反应放大目标RNA。在PCR之前加入逆转录酶(RT)可以扩增和检测RNA靶标。

逆转录酶转录模板RNA并形成互补DNA (cDNA)。单链cDNA通过DNA聚合酶转化为双链DNA。这些DNA分子现在可以用作PCR反应的模板。

目前，单热性DNA聚合酶也具有显著的逆转录酶活性被用于单步反应。

RT-PCR原理

逆转录和PCR扩增可在a中作为两步过程进行单管或与两个独立的反应．在这两种情况下，RNA首先被反转录成cDNA，然后被用作PCR扩增的模板。

用于cDNA合成的引物可以是非序列特异性引物(随机六聚体或寡聚dt引物的混合物)，也可以是序列特异性引物。

Non-sequence-specific引物:
- 随机五个一是六种核苷酸序列的所有可能组合的混合物，它们可以随机附着在mRNA上，并启动整个RNA池的逆转录。
- Oligo-dT引物与mRNA分子的poly-A尾互补，只允许从mRNA分子合成cDNA。
Sequence-specific引物:
- 序列特异性引物是最受限制的，因为它们被设计成选择性地结合感兴趣的mRNA分子，这使得逆转录成为一个目标特异性的过程。

cDNA合成和PCR在一个单一的反应容器中进行，在一个共同的反应缓冲液中。基因特异性引物指导cDNA的合成和特定靶点的扩增。一步反应的主要优点包括最小的样品处理，减少实验时间，和闭管反应，减少移液错误和交叉污染的机会。

RNA样本的质量和稀缺性影响了一步RT-PCR的效率。cDNA合成产物在一步RT-PCR后无法保存，因此需要额外的原始RNA样本等分，以便重复反应或评估其他基因的表达。

在两步RT-PCR中，cDNA合成使用随机六聚体、寡聚dt引物和/或基因特异性引物，从而得到cDNA分子的混合物。这样合成的cdna使用特定的引物进行扩增。

在两步RT-PCR中，cDNA在一个反应中合成，然后将cDNA的另一段用于后续的PCR实验。这需要额外的开管步骤，更多的移液操作，以及更长的操作时间，这可能导致更大的可变性和污染风险。剩余的cDNA可以存储以供将来使用，或者从单个RNA/cDNA样本中定量多个基因的表达。

许多临床重要病毒的基因组都是由RNA组成的，RT-PCR是检测这类病毒的有效方法。RT-PCR还被用于检测脑膜炎和脑膜脑炎的病毒原因，如肠道病毒和西尼罗河病毒。RT-PCR用于检测以下病毒:

定量RT-PCR法常用来检测艾滋病毒和丙肝病毒病毒载量(病人血液中这些病毒的数量)检测。

病毒载量数据对于监测个体患者对治疗的反应很重要。例如，在适当的抗逆转录病毒治疗后，感染艾滋病毒的患者应表现出CD4计数增加和艾滋病毒载量下降。

RT-PCR也可以使用检测其他微生物(细菌、寄生虫和真菌)通过靶向它们的rRNA。这种方法比检测DNA更好，因为RNA的存在更可能与DNA的存在有关可行的生物。

RT-PCR检测mRNA有助于研究基因表达微生物和人类宿主细胞。