海马酸水解发生在生物体中，可形成甘氨酸和苯甲酸。
在经典试验(48小时)中，以氯化铁为指示剂检测苯甲酸的产生。的气液色谱法本方法还可用于苯甲酸的检测。
相反，快速测试(2小时)检测甘氨酸，Hippurate水解的第二副产物。它使用茚三酮作为指示剂。快速Hippurate水解与经典方法相比具有更高的特异性和灵敏度。
Hippurate水解原理
在马尿酸酶的作用下，马尿酸水解为苯甲酸和甘氨酸。加入茚三酮试剂可检测甘氨酸。茚三酮与甘氨酸反应形成深蓝色或紫色(鲁赫曼紫)。Hwang和Ederer描述了这一点甘氨酸快速检测方法。
类似地，传统方法用氯化铁检测苯甲酸。氯化铁溶解苯甲酸存在的残渣后，离心的hippurate溶液与测试生物。
使用海马酸水解反应
hippurate测试识别空肠弯曲杆菌，单核增生李斯特菌，阴道加德纳菌,链球菌agalactiae。
- 马蹄酸盐水解试验是分离的关键空肠弯曲杆菌(水解hippurate)和弯曲杆菌杆菌(负面)菌株。
- 它还有助于区分β-溶血链球菌agalactiae来自其他β-溶血性链球菌。
测试程序
经典的方法
- 首先，取或配制无菌的海马酸钠肉汤，与被试生物接种。
- 然后在35°C下孵育一夜。
- 然后,离心机把肉汤倒进去，去掉沉淀物。
- 最后，在上清液中加入氯化铁试剂。
- 如果10分钟后残留，说明存在苯甲酸。该试验为海马酸水解阳性。
茚三酮法
- 首先，在hippurate试管中加入0.2ml(3-4滴)的蒸馏水，pH值为6.8-7.2。
- 然后，使用重从18-24小时的培养中接种，使生物在标准的hippurate试剂中大量悬浮接种环(接种后管子应浑浊，浑浊)。
- 之后，将试管在35-37°C下孵育两小时。
- 在孵育期间，在滴管瓶中加入2ml蒸馏水(pH值6.8-7.2)，重新配制茚三酮指示液。将瓶头和瓶盖放回原处，用力摇晃一分钟。在室温下放置30分钟或直到所有基质溶解。
- 2小时孵育期后，向hippurate试剂和生物体混合物中加入两滴茚三酮指示液。
- 然后在35-37°C下再次孵育30分钟。
- 之后，每隔10分钟观察一次外观呈深蓝色，这是一个积极的测试。通常在添加茚三酮指示液后10 ~ 15分钟会出现颜色变化。
解释的水解试验
- 茚三酮测试的阳性反应是在30分钟内出现深蓝色(大约水晶紫的阴影)。
- 而阴性反应则表现为淡紫色或无颜色变化。
质量控制用于Hippurate水解试验
用已知的阳性和阴性对照对每批新试剂进行测试，并至少每月重新测试一次。丢弃所有试剂，如果试剂没有通过QC，准备新的试剂。种植写明ATCC菌株在河马酸钠肉汤中进行质量控制并观察结果。
- 链球菌agalactiae(ATCC 4768):中度到重度生长和水解的hippurate。
- 酿脓链球菌(ATCC 19615):中度至重度生长;河马酸未水解。
Hippurate水解试验阳性生物:
海马酸水解试验用于各种细菌的推定鉴定。给出阳性(+ve)测试的生物有:
- 加德纳菌属鞘突,
- 空肠弯曲杆菌,
- 单核细胞增多性李斯特氏菌而且
- 乙组链球菌(链球菌aglactiae）
限制
- 如果与茚三酮孵育超过30分钟，就会出现假阳性结果。
- 阴性测试不排除鉴定g .鞘突因为引起细菌性阴道病的生物类型可能是hippurate阴性。
- 绿藻群链球菌可为hippurate阳性;进行其他测试以确认非溶血性菌落的鉴定是必要的。
- 少量肠球菌是β -溶血的，可能水解hippurate，但它们确实是吡咯烷基-β-naphthylamide (PYR)正面的(美国agalactiaePYR为阴性)
- 此外，一小部分的c .空肠生物是河马阴性和使用其他方法进行完全鉴定是必要的。
参考文献和进一步阅读
- 临床微生物程序手册，第四版。(2016)。在临床微生物程序手册，第四版．美国微生物学会。https://doi.org/10.1128/9781555818814
- 诊断微生物学彩色图集与教材，科尼曼，第5版
又短又甜。优秀的先生。
如何使用马尿酸进行马尿酸水解试验