设计一对好的PCR引物可能是成功的PCR反应最重要的因素。引物是一段短的、合成的单链DNA序列，与DNA的模板区互补。PCR反应需要两个互补的寡核苷酸引物;正向底漆和反向底漆。正向引物退火所述待扩增DNA片段的上游区域，反向引物退火所述待扩增DNA的下游区域。
引物是决定PCR实验成败的关键。如果引物设计正确，实验结果是扩增出模板分子的目标区域，但如果引物设计错误，实验可能会失败，因为没有扩增或扩增出错误的片段。设计一款有效的底漆可能有点棘手，有很多设计方法，而且必须考虑到一些小细节。
设计特定引物的过程通常包括两个阶段。
- 引物的侧翼感兴趣的区域是使用生物信息学工具生成的。
- 使用基本局部比对搜索工具(BLAST)等工具对核苷酸序列进行引物对搜索，以检查潜在目标。
PCR引物设计考虑
在设计成功的PCR引物时，你需要考虑几个特性。有些是;
- 引物特异性
- 底漆的长度
- 引物的退火和熔化温度
- 引物的GC含量，
- GC钳和
- 底漆的二级结构
引物特异性
设计与DNA模板区互补的引物。必须确保退火到感兴趣的基因以外的序列的可能性是非常低的。引物特异性通常取决于长度和退火温度。一个序列同源性搜索(如引物爆炸)与NCBI等公共基因组数据库中的已知模板序列进行比对，有助于确定其特异性。
引物长度
以18-24碱基对的PCR引物为最优引物，可获得最佳的产量。长度足够长，以获得足够的特异性。此外，它足够短，引物在退火温度下容易结合到模板上。
如果引物太短，它们会产生更多的非特异性DNA扩增产物。但另一方面，如果它们太长就会导致低杂化率。
退火和熔化温度
的退火温度为引物与模板DNA杂交的温度。退火温度影响反应的特异性。如果退火温度过高，引物和模板保持分离，但如果退火温度过低，引物可能与模板非特异性结合。
的理想退火温度必须足够低，以使引物和模板DNA之间的杂交，但又足够高，以防止错配杂交的形成。两种引物的退火温度应接近。退火温度应低于熔化温度5度，以便大多数引物与模板结合。然而，进一步降低温度可能会导致更多的非特异性结合。
的熔化温度(Tm)在这个温度下，一半的引物会从DNA中分离出来。两种底漆(正向底漆和反向底漆)理想情况下应该具有相似的熔化温度。Tm在52-58°C范围内的引物通常产生最好的结果。熔化温度高于65°C的引物有二次退火的倾向。
如果引物的Tm很低，包括GC含量更高的序列，或者稍微延长引物的长度可能会有所帮助。
序列的GC含量可以很好地反映引物Tm。有很多工具可以帮助你在线计算Tm，但有一种简单的方法可以让你快速进行粗略的计算。只需在引物序列中为每个G或C添加4摄氏度，为每个A或T添加2摄氏度。这个计算是基于计算寡核苷酸熔化温度的Wallace-Itakura公式；
Tm= 2 (A+T) + 4 (G+C)
引物GC含量
较高的GC含量(引物中G和C的数量占总碱基的百分比)确保了引物与模板DNA之间更稳定的结合，因为G-C碱基对比a - t碱基对更强。引物的理想GC含量为40-60%。例如，如果一个引物总共包含20个碱基对，有6个g和4个c，它将有50%的GC含量。
GC碱基对很有用，因为它们有三个氢键，比AT对多一个。因此，GC对有助于促进与模板DNA更强和更特异性的结合。
GC夹
你还需要在底漆的3 '端安装GC钳。在引物的3 '端加入2 - 3个g和c有助于促进引物与模板之间的特异性结合。
引物在3 '端应该有2 - 3个G和C，以便更特异性地与模板DNA结合，但应避免超过3个G和C，因为这可能导致引物-二聚体的形成。
二级结构
根据引物的顺序它有可能形成发夹状或二聚体它本身或其他引物。这意味着它可以与自己或与其他引物配对，而不是模板。
引物二聚体
引物二聚体(PD)由两个引物分子相互杂交而不是模板组成，因为引物中有互补的碱基串。为了防止引物二聚，应该避免正向引物和反向引物之间存在相同的核苷酸(即引物间同源性)。
此外，要注意核苷酸序列中重复序列的存在。过多的重复会导致错误引物，引物会退火到意想不到的位置。为了防止二聚和错误启动，避免运行4个或更多的一个碱基或二核苷酸重复序列(例如accc或ATATATAT)。同样，避免引物内同源性，即引物内存在3个以上互补的碱基。
可以使用各种在线工具来警告特定核苷酸序列中潜在的发夹、自二聚体或交叉二聚体的形成。例如,mfeprimer - 3.0是一种可以用来检查PCR引物质量的工具。它用于检查候选引物中是否存在非特异性扩增子、二聚体、发夹等。
如果你的引物没有给你想要的PCR产物，你可以试着改变PCR反应的条件，比如退火温度。如果仍然没有任何运气，可能是时候回到画板，重新设计你的底漆了。
设计引物
如果你知道你感兴趣的基因的基因序列，并想要扩增整个基因，那么设计引物就非常简单了。
- 正向引物:你感兴趣基因的前20个核苷酸序列可以作为你正向引物的引物序列。
- 反向引物
- 选择你感兴趣的基因的最后20个核苷酸序列。
- 过去的序列代码在文本框中这个链接．
- 按反补键
- 你得到的基因序列就是反向引物。
人工选择最优PCR引物组可能相当繁琐，所以目前，合适的PCR引物是使用软件程序或在线工具，如引物BLAST，Eurofins底漆设计工具等。引物设计软件的先验集选择算法，根据用户指定的参数(如熔点、GC含量、引物长度等)，对不同的序列进行计算分析，选出最佳的引物候选。
采用NCBI BLAST底漆设计底漆
你也可以使用NCBI引物BLAST工具设计PCR引物。查看详细的方法
底漆的使用
引物除了在PCR方法中扩增感兴趣的靶基因外，还用于DNA测序和其他实验过程，如基因分型(检测特定细胞或生物体中等位基因的序列变异)，克隆感兴趣的DNA片段和诱变(引入所需的基因)188.博金宝 进入感兴趣基因，研究基因表达等属性)。
参考资料及进一步阅读
- 王坤，李海伟，徐玥，邵倩芝，易建明，王瑞超，蔡万石，杭兴义，张成刚，蔡浩阳，曲武斌，MFEprimer-3.0: PCR引物的质量控制，核酸研究，第47卷，第W1期，2019年7月02日，W610-W613页，https://doi.org/10.1093/nar/gkz351．
- PCR引物设计要点．ThermoFisher科学。检索于2022年6月24日。
- 如何设计PCR引物．Addgene。检索于2022年6月24日。
- PCR引物设计指南．总理Biosoft。检索于2022年6月26日。