氧化酶测试是一种检测有氧呼吸中称为细胞色素C氧化酶或细胞色素a3的末端酶系统存在的技术。通常，肠杆菌科给出阴性结果，然而假单胞菌spp,气单胞菌属spp,弧菌spp,奈瑟氏菌属SPP结果为阳性。
氧化酶测试原理
氧化酶测试用于鉴定细菌产生细胞色素c氧化酶，细菌电子传递链的酶。出席时，细胞色素c氧化酶氧化试剂(tetramethyl-p-phenylenediamine盐酸盐)来靛酚，一种紫色或深蓝色的最终产品。当酶不存在时，试剂保持还原状态，是无色的。
所有氧化酶阳性的细菌都是好氧的，在呼吸过程中可以将氧作为末端电子受体。这并不意味着它们是严格的需氧生物。氧化酶阴性的细菌可以是厌氧的、好氧的或兼性的;氧化酶阴性结果仅仅意味着这些生物没有氧化测试试剂的细胞色素c氧化酶。它们可能在电子传递中使用其他氧化酶进行呼吸。
氧化酶试验要求
- 湿润的滤纸与基材(1%四甲基对苯二胺二盐酸盐)，或商业准备的纸盘，木丝，或铂丝。
- Kovács氧化酶试剂(1%四甲基-对苯二胺二盐酸盐，水)。在黑暗的瓶子中冷藏不超过1周。
氧化酶试验程序
氧化酶测试可以用多种方法进行。这些包括但不限于滤纸测试，滤纸斑点试验，直接平板法,试管法．
滤纸测试方法
- 将一小张滤纸浸泡在1% Kovács氧化酶试剂中，晾干。
- 使用无菌循环从新鲜的(培养18- 24小时)细菌板中挑选一个分离良好的菌落，并将其擦在处理过的滤纸上。
- 观察颜色的变化。
注:镍、钢等导线环会出现假阳性结果，因此应使用铂或惰性转移环。可供选择的方法有玻璃棒、木棍、无菌塑料环、无菌牙签和无菌棉签。
oxidase-negative大肠杆菌(右)。
结果
- 氧化酶阳性:颜色在5 - 10秒内变为深紫色。
- 延迟氧化酶阳性:颜色在60 ~ 90秒内变为紫色。
- 氧化酶阴性:颜色不变或时间超过2分钟。
滤纸点法
- 使用循环从新鲜的细菌板中挑选一个分离良好的菌落，并将其擦在一小张滤纸上。
- 滴1或2滴1% Kovács氧化酶试剂在生物体涂片上。
- 观察颜色的变化。
oxidase-negative大肠杆菌(右)。
结果
- 氧化酶阳性:颜色在5 - 10秒内变为深紫色。
- 延迟氧化酶阳性:颜色在60 ~ 90秒内变为紫色。
- 氧化酶阴性:颜色不变或时间超过2分钟。
直接平板法
结果
- 氧化酶阳性:颜色在5 - 10秒内变为深紫色。
- 延迟氧化酶阳性:颜色在60 ~ 90秒内变为紫色。
- 氧化酶阴性:颜色不变或时间超过2分钟。
试管法
- 在4.5毫升营养肉汤(或不含高浓度糖的标准培养基)中培养新鲜的细菌(18至24小时)。
- 加入0.2 ml 1% α-萘酚，然后加入0.3 ml 1%草酸帕氨基二甲基苯胺(Gaby和Hadley试剂)。
- 观察颜色的变化。
氧化酶积极奈瑟氏菌属新铸的卢比(左)氧化酶阴性金黄色葡萄球菌(右)
结果
- 氧化酶阳性:颜色在15 - 30秒内变为蓝色。
- 延迟氧化酶阳性:2 ~ 3分钟内颜色变为紫色。
- 氧化酶阴性:颜色无变化
氧化酶试验用途
- 氧化酶试验最有助于筛选菌落中疑似存在的一员肠杆菌科家庭;肠杆菌科的所有成员包括大肠杆菌都是氧化酶阴性。
- 为避免错误识别，对所有革兰氏阴性棒进行氧化酶测试。氧化酶检测在分离中尤为重要气单胞菌属从肠杆菌科。
注意:如果你在培养基中看到成群的菌落，不要进行氧化酶测试，因为它是变形杆菌的独特特征，氧化酶为阴性。 - 氧化酶试验是用来作为鉴定革兰氏阴性棒的一个主要特征肠杆菌科家庭。被怀疑属于其他属的菌落气单胞菌，假单胞菌，奈瑟菌，弯曲杆菌,巴斯德菌氧化酶阳性。
- 革兰氏阴性双球菌有阳性反应。属的所有成员奈瑟氏菌属氧化酶阳性。莫拉克斯氏菌属spp．革兰氏阴性双球菌或葡萄球菌也是氧化酶阳性。
质量控制
表现出阳性和阴性反应的细菌种类应作为对照，经常进行试验。建议如下:
A.氧化酶阳性:假单胞菌绿脓杆菌
B.氧化酶阴性:大肠杆菌
注意事项和限制
- 时间对准确的测试至关重要。
- 使用新鲜试剂，不超过1周，旧试剂会自氧化从而给出错误的结果。如果试剂或滤纸是紫色的，请不要使用。
- 不要测试生长在含有葡萄糖或染料的培养基上的生物体(例如，麦康基琼脂或伊红美蓝琼脂）.
- 不要使用含铬和铁的镍基合金线(镍铬合金)来挑选菌落并进行涂片，因为这可能会产生假阳性结果。
- 在含有染料的培养基上生长的细菌可能会产生异常的结果。
- 较老的培养物代谢活性较低，因此可能在上述观察时间内给出假阴性结果。
氧化酶测试必须从5%的羊中进行血琼脂或者另一种不含发酵糖的培养基。碳水化合物的发酵导致介质酸化(例如，乳糖MacConkey琼脂或TCBS中的蔗糖)，如果周围的pH值低于5.1，氧化酶测试可能会出现假阴性结果。Subinoculation上营养琼脂在进行氧化酶测试之前必须进行。
在确认嫌疑期间霍乱弧菌分离，它是不可能执行氧化酶测试直接从一个tcb文化因为蔗糖发酵菌落产生的酸会抑制氧化酶反应。
氧化酶阳性生物列表
氧化酶阳性的细菌属包括奈瑟氏菌属而且假单胞菌等．属肠杆菌科家庭的特征是氧化酶阴性。
氧化酶阳性生物的助记法PVNCH(它只是一个缩略词，灵感来自于著名的助记符脲酶阳性生物-穿孔）
参考文献和进一步阅读
- 帕特里夏·希尔兹，劳拉·卡斯卡特，2010年。氧化酶试验方案．
- 临床微生物程序手册，第四版。(2016)。美国微生物学会。https://doi.org/10.1128/9781555818814
