最可能数(MPN)用于估计样品中活菌的浓度，方法是在十倍稀释的液体肉汤中复制生长。它通常用于估算土壤、水和农产品中的微生物种群。MPN测试对于含有微粒物质的样品特别有用板数枚举方法。
MPN最常用于水质测试，即以确保水的细菌含量是否安全．一组通常被称为粪便大肠菌群的细菌作为粪便污染水的指标。少量粪便大肠菌群的存在表明水可能不含有致病生物，而大量粪便大肠菌群的存在则表明水极有可能含有致病生物，使水不安全饮用。
原则
将待测水连续稀释并接种在乳糖肉汤中，如果水中存在大肠菌群，则利用介质中存在的乳糖产生酸和气体。酸的存在是由介质的颜色变化来指示的，气体的存在是由介质中存在的倒置达勒姆管中收集的气泡来检测的。总大肠菌群的数量是通过计数给予阳性反应的管数来确定的(即颜色变化和产气)比较阳性结果的模式(每次稀释时显示增长的管数)有标准统计表。
MPN测试分3步进行
- 假定测试
- 证实试验
- 完成测试
假定测试
假定测试是一种筛选测试，以对存在大肠菌群的水进行取样。
如果假定的检测结果为阴性，则不再进行进一步的检测，并且水源被认为是微生物安全的。
如果假定的检测结果为阴性，则不再进行进一步的检测，并且水源被认为是微生物安全的。然而，如果该系列中的任何管子显示酸和气体，则认为水是不安全的，并对显示阳性反应的管子进行确认测试。
经过处理的水和未经处理的水的假定测试方法各不相同。
需求
- 中号:乳糖肉汤或麦康基肉汤或月桂基胰糖(乳糖)肉汤
- 玻璃器皿:各种容量的试管(20ml, 10ml, 5ml)，达勒姆管
- 其他:无菌移液管
培养基的制备
- 准备培养基(麦康基肉汤或乳糖肉汤)在单强度和双强度浓度。
- 对于未经处理或受污染的水:
- 在10管中加入双强培养基(每管10mL)，在5管中加入单强培养基(每管10mL)，并在反向位置加入达勒姆管。
- 处理过的水:
- 将双强培养基分5管(每管10mL)，单强培养基50 mL分1瓶，并倒置加入达勒姆管。
- 检查管子，确保内瓶中充满液体，没有气泡。
- 消毒的在15磅压力下(121°C)高压灭菌15分钟．
MPN测试程序
用于未经处理(污染)的水
- 为每个待测水样取5管双强度水和10管单强度水。
- 用无菌吸管将10毫升水加入5支含有10毫升双倍强度介质的试管中。
- 同样，在5支含有10ml单一强度介质的试管中加入1ml水，在剩下的5支含有10ml单一强度介质的试管中加入0.1 mL水。
- 所有试管在37°C下孵育24小时。如果没有试管出现阳性，重新孵育48小时。
- 将反应呈阳性的试管数量与标准图表进行比较，并记录其中存在的细菌数量。
例如，测试的水样显示3-2-1的结果(3 × 10 mL阳性，2 × 1 mL阳性，1 × 0.1 mL阳性)给出的MPN值为17，即水样每100毫升含有估计的17个大肠菌群
要查看完整的表格，请从参考文献中提供的链接下载PDF文件。
用于处理过(未污染)的水
- 为每个待测水样取1管单剂量(50mL)和5管双剂量(10mL)。
- 用无菌吸管向含有50毫升单强度介质的试管中加入50毫升水。
- 同样，向5个含有10ml双倍强度介质的管子中加入10ml水。
- 在37°C下孵育24小时。如果没有试管出现阳性，重新孵育48小时。
- 将反应呈阳性的试管数量与标准图表进行比较，并记录其中存在的细菌数量。
例如，测试的水样显示结果为1-4 (1 × 50 mL阳性，4 × 10 mL阳性)，则MPN值为16，即水样每100 mL含有估计的16个大肠菌群。
证实试验
大肠菌群以外的一些微生物也从乳糖发酵中产生酸和气体。为了确认大肠菌群的存在，进行了验证性试验。
从每个结果为阳性的发酵管中转移一环培养基到:
- 3 mL乳糖肉汤或亮绿色乳糖发酵管，
- 对琼脂倾斜和
- 3毫升色氨酸水。
接种后的乳糖肉汤发酵管在37℃下孵育，24±2小时后检查气体形成情况。如果没有产气，进一步培养最多48±3小时，以检查产气情况。
琼脂斜体应在37°C孵育24±2小时Gram-stained准备由斜面制成的应在显微镜下检查。
乳糖肉汤中气体的形成和相应琼脂中革兰氏阴性、非孢子形成杆菌的显示表明存在大肠菌群的一员在样本检查中。
乳糖肉汤中没有气体形成或在相应的琼脂斜面中未能证明革兰氏阴性、非孢子形成杆菌构成阴性试验(测试样本中无大肠菌群)．
色氨酸水试验
- 将色氨酸水在(44.5±0.2°C)孵育18-24小时
- 孵育后，加入约0.1mL的Kovacs试剂，轻轻混合。
- 的吲哚的存在在科瓦奇试剂中以红色表示，在介质的水相上形成一层薄膜。
a.吲哚、生长和产气的验证性测试呈阳性，表明存在耐热性大肠杆菌。
b.在没有吲哚的情况下生长和产气证实存在耐热大肠菌群。
完成测试
由于确认性试验的一些阳性结果可能是假的，最好做完整的试验。为此，从确认试验的每个阳性试管中接种物在EMB或远藤琼脂板上划一条。
在此过程中，从每个阳性BGLB管中提取的满满一环样品被划到选择性介质上伊红亚甲基蓝琼脂或者远藤介质。分别在37°C和44.5±0.2°C孵育24小时。
高温孵育(44.5±0.2)用于检测耐热性大肠杆菌。
孵育后，检查所有培养皿是否存在典型菌落。
- 大肠菌群产生具有绿色金属光泽的菌落，这与非大肠菌群(无光泽)不同。在高温下(44.5±0.2)存在典型菌落表明存在耐热性大肠杆菌。
MPN的优点
- 易于解释，无论是通过观察还是气体排放
- 样品毒素被稀释
- 分析高度浑浊样品如沉淀物、污泥、泥浆等的有效方法。
- 这是不能通过膜过滤来分析的。
MPN的缺点
- 需要很长时间才能得到结果
- 结果并不十分准确
- 需要更多的硬件(玻璃器皿)和媒体
- 误报概率
参考资料及进一步阅读
