聚合酶链反应(PCR)是复制或扩增DNA或RNA小片段的一种高效、经济的分子工具。PCR结合了核酸互补杂交的原理和核酸复制的原理，通过多次循环重复应用。它导致特定目标DNA/RNA序列的指数级生产在相对较短的时间内增加了10^7倍。
这体外扩增技术可以通过使用两个合成的寡核苷酸来扩增核酸目标的单个拷贝。引物与目标基因组序列结合，目标基因组序列被延长了一个聚合酶(耐热性DNA聚合酶)。重复循环的自动过程(通常为25至40次)变性模板DNA(94°C)，退火的引物到它们的互补序列(50°C)，和引物延伸(70°C)用于扩增目标序列。
PCR最初是在1983年由美国生物化学家和诺贝尔奖得主卡里·穆利斯。
引物:核苷酸的一小段，与DNA或RNA的一部分互补，在聚合酶链反应中扩增。PCR中使用两个短的DNA序列来结合目标序列的起始(正向引物)和末端(反向引物)。
聚合酶:一种热稳定的DNA聚合酶，最初从嗜热细菌中分离出来水生栖热菌，在变性温度下抗失活，并允许引物在高温下延伸。
聚合酶链反应(PCR)的组成
- DNA模板(包含目标扩增序列的样本DNA)
- 三磷酸脱氧核糖核苷
- PCR缓冲
- 引物(正向和反向)
- 聚合酶
p的步骤聚合酶链反应
为了进行PCR，将提取的样本(包含目标DNA模板)添加到含有引物、游离核苷酸(dNTPs)和Taq聚合酶的管中。将聚合酶链反应混合物置于聚合酶链反应机中。PCR机在自动的、程序化的步骤中增加和降低PCR混合物的温度，以指数方式产生目标序列的拷贝。
聚合酶链反应(PCR)三个主要步骤。
- 变性(链分离):通过加热(94°C至96°C)将DNA的两条氢键互补链分离成一对单链多核苷酸分子
- 退火(引物结合):温度降低(45-60°C)，这样引物就可以附着在单链DNA链上。
- 延伸(新DNA的合成):它从退火引物开始，沿着DNA链(72°C)工作。
一旦第一轮反应完成，循环回到第一轮反应温度，重复该过程，并开始下一轮变性、退火和延伸(热循环器中的自动过程)．这3步温度循环重复约30次，结果是目标基因序列呈指数扩增。
动画
PCR产物检测
标记探针用于检测PCR扩增的基因产物(也称为扩增子)。根据所使用的报告分子的性质，探针产生放射性、比色、荧光或化学发光信号。基于探针的扩增子检测有两个目的
- 它允许PCR产物的可视化
- 它通过确保扩增子是感兴趣的目标序列而不是非特异性扩增的结果来提供特异性。
除了基于DNA的杂交方法外，有时简单的凝胶电泳方法足以确认特定扩增子的存在。
聚合酶链反应的类型
已经开发了几种PCR方法的修改，以增强该方法在基于其应用的诊断设置中的效用。一些常见的PCR类型是;
- 实时荧光定量PCR (quantitative PCR或qPCR)
- 逆转录酶(rt - pcr)
- 多重聚合酶链反应
- 嵌套PCR
- 高保真PCR
- 快速PCR
- 热态启动聚合酶链反应
- GC-rich PCR
- 远程PCR
- 任意引物聚合酶链反应
PCR的应用
- 传染因子的鉴定和表征
- 直接检测患者标本中的微生物
- 培养物中微生物的鉴定
- 抗菌素耐药性检测
- 一种感兴趣病原体菌株亲缘关系的调查
- 基因指纹鉴定(法医应用/亲子鉴定)
- 检测188.博金宝 (遗传疾病调查)
- 克隆基因
- PCR测序
参考资料和进一步阅读:
- 动画来源:dnalc.org
- 图片来源:Wikipedia.org
- 贝利和斯科特的诊断微生物学- 12版
