凝固酶试验:原理，程序，结果

凝血酶试验有助于鉴别金黄色葡萄球菌它产生凝固酶(凝固酶)血浆从凝固酶阴性葡萄球菌(CONS)。凝固酶也是毒力因子金黄色葡萄球菌，将血浆中可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白，使纤维蛋白包裹在细菌细胞表面，使其免受调理作用吞噬作用．金黄色葡萄球菌产生两种形式的凝固酶，结合和自由;

1. 滑动凝固酶试验用于检测结合凝固酶或结块因子。
2. 用试管凝固酶试验检测游离凝固酶。

玻片凝血酶试验

玻片凝固酶试验检测“结合凝固酶”或“结块因子”。结块因子是一种纤维蛋白原结合细胞表面受体，存在于大多数，但不是所有，金黄色葡萄球菌。的凝结因子直接作用于血浆中的纤维蛋白原，导致结块。玻片凝血酶试验快速，但需要数个菌落，敏感性不足。

由于不存在所有的结块因素金黄色葡萄球菌，部分菌株玻片凝固酶试验呈阴性。此外，细胞表面囊多糖可以掩盖结块因子。因此，滑动试验阴性必须通过试管凝固酶试验来证实。其他种类的葡萄球菌，即美国lugdunensis而且美国schleiferi可能给阳性玻片凝固酶试验结果。

注意:殖民地来自甘露醇盐琼脂培养物不适合用于凝固酶检测。有机体必须首先培养营养琼脂或血琼脂．

玻片凝固酶试验程序

1. 将葡萄球菌菌落在一滴水中乳化，放在干净无油的载玻片上，尽量减少扩散(如果分离物没有形成光滑的乳白色悬浮液，则不要进行测试)。
2. 将对照阳性和阴性菌株作类似的悬液，以确认血浆的适当反应性。
3. 在室温下，将点燃并冷却的直接种丝浸入未稀释的血浆中，取出，并将粘附的血浆痕迹(不是一圈)搅拌到载玻片上的葡萄球菌悬浮液中。点燃电线，重复控制悬挂。
4. 读数为阳性10秒内肉眼可见粗结块尾蚴。如果没有结块或出现超过10秒的反应，则读数为阴性，但要重新检查反应缓慢的菌株管状凝固酶试验．

观察

1. 凝固酶阳性:在凝固血浆滴中肉眼可见10秒或更短时间内结块，在盐水或水滴中无结块。
2. 凝固酶阴性:两滴均无结块

解释

玻片凝固酶试验是鉴别的主要方法金黄色葡萄球菌在临床实验室，但它有一些局限性。

1. 约占普通菌株的15%金黄色葡萄球菌还有更多耐甲氧西林金黄色葡萄球菌给出消极的反应。
2. 凝固酶阴性葡萄球菌很少有阳性反应。

请注意:均为凝固酶阴性切片必须使用凝血酶试验作为确定的测试金黄色葡萄球菌。

管状凝固酶试验

管状凝固酶试验检测与凝固酶反应因子(CRF)反应的游离凝固酶(葡萄凝固酶)。CRF是一种凝血酶样分子．葡萄凝固酶和CRF结合可间接将纤维蛋白原转化为纤维蛋白。将该生物的悬浮液悬浮液与血浆在37°C下孵育。4小时内血栓形成表明检测呈阳性。

这样形成的凝固酶凝块可以被破坏金黄色葡萄球菌纤维蛋白溶解素或葡萄激酶，一种质粒携带的酶，在35°C时比在25°C时更活跃。因此，必须定期检查凝血酶管(1,2,4小时)是否有血栓形成。负极管应在室温下放置一夜。

管凝血酶试验程序

1. 在生理盐水(0.85% NaCl)中准备1 / 6稀释血浆，并将1ml体积的稀释血浆放入小管中。
2. 将几个分离的测试生物体菌落乳化在1毫升稀释的兔血浆*中，得到乳白色的悬浮液。
3. 将试管在35°C环境空气或水浴中孵育4小时。
4. 在1、2和4小时时，通过将导管倾斜至90度来检查血栓的形成°。
5. 将负极管置于室温下过夜，然后重新检查。
   (这一步是必不可少的，对于一些金黄色葡萄球菌菌株，包括许多MRSA产生延迟凝块在37度迅速裂解°C由生物体的葡萄激酶引起。)

观察

任何程度的血块形成都是阳性。通常情况下，当试管倾斜或倒置时，血浆会转化为坚硬的凝胶，但有时会看到凝块漂浮在液体中。

1. 凝血酶阳性:任何大小的血块。金黄色葡萄球菌
2. 凝血酶阴性:无凝块(血浆完全保持液态或仅显示为絮状或粘稠沉淀)。如。葡萄球菌epidermidis

注意:兔血浆更可取，因为它凝血效果更好，不含抑制剂，而且安全。人血浆中含有柠檬酸钠作为抗凝血剂，一些柠檬酸钠利用细菌，如粪肠球菌会破坏抗凝血剂，引起凝血。如果血浆不是无菌的，就会出现假阳性或假阴性结果。

报告

• 报告金黄色葡萄球菌试管凝固酶试验阳性，生物体过氧化氢酶阳性和革兰氏阳性球菌群集。
• 对于过氧化氢酶阳性的试管凝固酶试验阴性，具有乳白色菌落的革兰氏阳性球菌簇报告为“凝固酶阴性葡萄球菌”。
• 滑块凝固酶试验阳性可报告为金黄色葡萄球菌；然而，该测试应从无菌部位(如血液)的非溶血性或仅轻微溶血性菌落中分离出试管试验来确认金黄色葡萄球菌从美国lugdunensis而且美国schleiferi．
• 阴性凝血酶试验无效，应随后进行试管试验以确认。

质量控制

• 不要使用未经冷藏或冷冻或看起来浑浊的血浆。
• 在使用新批次前对凝固酶血浆进行质量控制。
• 生物
  • 金黄色葡萄球菌ATCC 25923 -凝固酶阳性
  • 葡萄球菌epidermidisATCC 12228或ATCC 14990 -凝固酶阴性

我从哪里可以得到血浆?

兔血浆可通过在血液中加入0.1% EDTA作为抗凝剂进行离心获得。或者，它可以从商业供应商那里获得冻干，并通过添加水重新构成。

含柠檬酸的人血浆可从血库获得，但血液必须经过筛选并无病毒(乙型肝炎抗原和抗体。处理它时必须采取适用于所有人体体液的预防措施。

将血浆分装在-20度的低温下°C，并在4点储存用过的血浆°C在使用前将其置于室温。

限制凝血酶试验

1. 不要使用柠檬酸血，因为可能出现假阳性结果。
2. 不要对生长在甘露醇盐琼脂上的菌落进行凝固酶测试。
3. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)可能缺乏结合凝固酶，这导致阴性滑动试验。
4. 美国的中间部而且美国hyicus试管试验可能呈阳性;这些物种通常分别只在狗和猪身上发现，但传染性与猪一样S.aureus当它们感染人类时。它们都在新鲜血液琼脂板上形成非溶血性菌落Voges-Proskauer负的，把它们分开S.aureus．美国的中间部也pyrrolidonyl -β-naphthylamide (PYR)积极的
5. 美国lugdunensis而且美国schleiferi玻片试验阳性，试管试验阴性。它们可以被分离金黄色葡萄球菌通过它们强烈的阳性PYR反应和从美国的中间部管凝血酶试验呈阴性。
6. 葡萄球菌argenteus是一种新的葡萄球菌，也是管凝酶阳性和PYR阴性。

参考文献和进一步阅读

• 临床微生物程序手册，第四版。(2016)。美国微生物学会。https://doi.org/10.1128/9781555818814
• 卡茨，d.s.(2010, 11月11日)。凝血酶试验方案．https://www.asmscience.org/content/education/protocol/protocol.3220
• 金黄色葡萄球菌:另一种凝固酶阳性葡萄球菌．ASM.Org。检索到2021年6月4日，从https://asm.org/Podcasts/Editors-in-Conversation/Episodes/Staphylococcus-Argenteus-Another-Coagulase-Positiv