血友病X和V因子试验

X因子(hemin)和V因子(烟酰胺-腺嘌呤-二核苷酸，NAD)需求试验进行识别和鉴别嗜血杆菌特别是鉴别流感嗜血杆菌这种细菌会导致脑膜炎、肺炎等致命疾病。

在血琼脂中，红细胞将NAD+(因子V)释放到培养基中，供细菌使用。相反，血红素与红细胞结合。除非细胞被其他细菌裂解，否则它不会释放到培养基中金黄色葡萄球菌或者像巧克力琼脂一样加热。

嗜血杆菌spp小，多形性，革兰氏阴性杆菌或随机排列的球菌。流感嗜血杆菌是一种挑剔的生物，生长最好在35-37°C和~5%的二氧化碳(或在一个蜡烛瓶)和成长需要X因素和V因素．流感嗜血杆菌没有补充就不能生长血琼脂板或任何其他通用媒介，例如胰蛋白酶大豆琼脂,或营养琼脂．血琼脂含有游离V，但不含X因子，而一般培养基既缺乏X因子又缺乏V因子。

嗜血杆菌ducreyi,性传播感染(生殖器下疳)的病原体需要X因子才能生长。相比之下,嗜血杆菌56(肺炎和心内膜炎的病原体)只需要因子V，可以在血琼脂上生长。

记住最常见的致病性嗜血杆菌的生长因子需求

嗜血杆菌parainfluenzae需要因子V (p意味着pannch = V)
嗜血杆菌ducreyi需要因子X（d- - - - - -dus表示X)
流感嗜血杆菌需要因子X和V

流感嗜血杆菌能在血液琼脂板上生长吗金黄色葡萄球菌．X因子，或hemin，是由周围的绵羊红细胞裂解葡萄球菌而葡萄球菌提供V因子或NAD。这些因素使微小的露珠菌落嗜血杆菌与…相邻生长葡萄球菌条纹，一种被称为satellitism。

巧克力琼脂(热裂解的羊血或马血琼脂)板是标准的培养基h .流感．

生长发生在巧克力琼脂因为在巧克力琼脂制备的加热过程中，NAD从红细胞中释放出来(加热过程也使生长抑制剂失活)。完整红细胞内的血红素不能被细菌接触到除非红细胞被其他细菌裂解或通过加热培养基制成巧克力琼脂。

生长因子需要量可以用琼脂扩散原理用含有X、V和XV因子的纸盘或条带。

过程:

1. 准备大量细胞悬液(1麦克法兰浊度标准)在生理盐水中。
   • 注意:重要的是不要携带任何x因子或V因子包含在提取有机体的培养基中。
2. 将无菌棉签浸入生物体悬浮液中。将棉签滚过胰蛋白酶大豆琼脂板的整个表面。
3. 将X、V和XV因子盘放在琼脂表面。如果使用单独的磁盘，请将它们分开放置至少4 ~ 5厘米。
4. 小心地翻转盘子，在35°C的温度下将其放入二氧化碳培养箱或蜡烛消光罐中培养一夜。

预期结果

流感嗜血杆菌将只在XV盘(即同时包含X和V因子的盘)周围生长。

增长约	推理
X磁盘	V磁盘	十五磁盘	整个琼脂表面
没有	没有	是的	没有	两者的要求X和V因素
没有	是的	是的	没有	要求V因素
是的	是的	是的	是的	不需要X或V因子

X和V因素要求

生物	X因素	V因子
流感嗜血杆菌	+	+
流感嗜血杆菌生物型aegyptius	+	+
h . haemolyticus	+	+
h . parahaemolyticus	- - - - - -	+
h . 56	- - - - - -	+
h . paraphrophilus	- - - - - -	+
h . segnis	- - - - - -	+
h . ducreyi	+	- - - - - -
h . aphrophilus	- - - - - -	- - - - - -

质量控制

1. 积极的:
   1. 流感嗜血杆菌会在XV盘周围出现生长的光晕;琼脂表面的其余部分将没有生长。
   2. 嗜血杆菌56将在XV盘和V盘周围显示生长的光晕。
2. 负
   1. 嗜血杆菌aphrophilus会在整个盘子表面生长。X、V、XV因素都不是生长所必需的。

注意:

h . haemolyticus也显示出类似的结果(仅生长在含有hemin和NAD的圆盘周围)。嗜血杆菌ID四边形板可以用来区分这两个分离株。h . haemolyticus在含马血的培养基上生长会产生β溶血，但是流感嗜血杆菌生长在这样的培养基上，但不溶血马的血细胞。

参考文献和进一步阅读:

1. 由。引起的脑膜炎的实验室诊断方法脑膜炎奈瑟氏菌，肺炎链球菌，而且流感嗜血杆菌(图片及流程图取自本手册)
2. Musher DM.嗜血杆菌种。在:男爵S，编辑。医学微生物学第四版。加尔维斯顿(德克萨斯州):德克萨斯大学加尔维斯顿医学分校;1996.章30。可从:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8458/