生物负荷测试:目的，程序和可接受水平-微生物在线

生物负荷描述了产品或无菌屏障系统中存在的活微生物的数量。生物负担可能由各种来源引入，如原材料、环境、清洁过程以及制造和组装部件。

生物负荷测试是一种推荐的方法，用于在进行灭菌前确定未灭菌材料或产品中活菌的总数和类型。它是选择正确的灭菌、定型和分配材料和产品的过程的关键方法。

生物负荷检测的关键步骤是从产品和医疗器械中收集微生物的样品或回收方法。生物负荷测试在制药行业、医疗设备制造商和化妆品行业中被广泛使用。

生物负荷测试的目的

生物负荷测试方法在对任何材料和产品消毒之前分离和列举活的微生物。这些检测方法在不同的实验室有许多不同的用途，具体如下:

它有助于找出生产各种产品的原材料和水的正确灭菌方法。
它还有助于确定生产后和使用前医疗设备中活菌的数量。
生物负荷测试有助于按照所遵循的规则或协议维持实验室标准。

生物负荷测试程序

生物负荷试验是测定总活菌数(TVC)的方法。生物负荷测试可以通过TAMC(需氧微生物总数)或TAMC和TYMC(酵母和霉菌总数)的组合进行。对于TAMC微生物倾注平皿而且铺板法使用。

在医疗器械中或在医疗器械上制造(原材料和包装实践)的生物负荷测试程序有以下四个不同的阶段:

微生物复苏:根据要测试的材料类型，有许多方法可以回收微生物样品。
1. 对于水样，过滤后电镀是首选。
2. 有时用超声波摇动材料，然后将物质过滤并置于琼脂培养基中。
3. 有时胃、漂洗和冲洗，然后在琼脂培养基上过滤和电镀。
4. 如果以上方法都不起作用，可以使用直接擦拭或接触板技术。
5. 然后用两种方法培养琼脂板。
  - 两种培养基方法:真菌特异性培养基SDA (Sarbouraud dextrose琼脂)25℃孵育2-7天。另一种tamc特定的媒体胰蛋白酶大豆琼脂37℃孵育18-48小时。
  - 单媒双温法:采用SCD(大豆酪蛋白消化)培养基等万能培养基，先在30-35℃下孵育2-3天，再在20-25℃下孵育5-7天。在低生物负荷地区是较好的处理方法。
微生物计数

然后用任一种方法枚举培养的微生物或然数(最可能数)，膜过滤，或有氧平板计数法。微生物负荷以CFU(菌落形成单位)表示，这有助于制定标准水平。

微生物污染水平表征

微生物的鉴定是通过各种方法进行的，比如细菌、菌落形态、革兰氏染色法，以及细胞形态。为酵母和霉菌的鉴定，观察菌落形态和不同类型真菌染色使用方法。

验证方法

在生物负荷恢复过程中使用计算出来的修正因子有助于从原始灭菌计数中计算生物负荷估计数。修正系数有助于验证恢复方法。

修正系数是由采收率(RE)提供的数值。RE有助于评估提取方法的效率。根据ISO 11737-1, RE有两种测量方法;接种恢复和重复提取(彻底恢复)．

在接种法中，该材料具有低生物负荷或预先灭菌，从而降低了其他竞争微生物的影响，以获得接种生物体的准确计数。RE是回收的目标微生物菌落数与阳性对照的比值。这是首选的方法。通常，一种孢子形成的微生物像芽孢杆菌应用于材料上，并让其干燥。

回收率(RE)=一次冲洗/接种群体的CFU回收率

在重复法中，产品样品冲洗(3 - 5次)。在每次提取后测量可活生物负荷。RE是通过比较(从所有漂洗中)回收的菌落总数与第一次漂洗来计算的。这种方法不适用于粉末、凝胶或任何其他溶解性物质。

回收率(RE)=总冲洗CFU/第一次冲洗CFU

校正因子= 1/RE

需要考虑的事项

在执行生物负荷时，需要考虑以下因素:

取样时间应在加工包装结束时。
样品应来自均质体。
无菌操作和技术要求。
应使用清洁和无菌的介质和容器。
正确的抽样、选择和鉴定方法是必要的。
必须在每次测试后对流程进行验证。
应制订一种适当的传播警报和行动级别的方法。
样品的过期时间会影响测试的有效性。

生物负荷测试的可接受水平

根据EMA(欧洲医学协会)的规定，在过滤得到的样品中，每100毫升不超过10 CFU是可接受的生物负荷测试水平。但是，这些级别因地区、公司和行业而异。

常见微生物

在生物负荷测试中常见的微生物是细菌种类。有时酵母和霉菌也可能被回收。

葡萄球菌物种
芽孢杆菌物种
大肠菌群(水样):大肠杆菌是最常见的大肠菌群从水样中获得的生物负担。
酵母
模具

生物负荷检测的应用

生物负荷测试是对容器、医疗设备、水、在制样品、灭菌前的最终散装产品、产品接触表面或需要经常评估生物负荷的材料等样品中的微生物的估计。执行生物负荷测试以验证灭菌方法也是常见的做法。通常应用生物负荷测试的一些领域是:

微生物学实验室:这些实验室经常与微生物打交道，但也需要无菌区来工作。因此，生物负荷测试被广泛用于测定好氧微生物总数(TAMC)。
医疗产品及器械制造公司:这些公司必须生产含有很少或几乎没有生物负荷的材料和设备，因为这些材料和设备经常与免疫功能低下的人接触。因此，对这些产品进行灭菌前生物负荷检测是首选和推荐的。验证灭菌方法是必要的。
制药行业:在制药工业中，灭菌前的口服药物的最终散装、用于生产药物的水、容器和表面经常被用作生物负荷测试的样本。
化妆品行业:化妆品和散装产品的原料在灭菌前要经过生物负荷测试。生物负荷测试也用于生产这些化妆品的设备。

微生物限度试验与生物负荷试验的区别

生物负荷检测是在非无菌、预无菌、未过滤和过滤样品中进行的定量方法。微生物限度试验(MLT)是对非无菌材料进行定性和定量的方法。

通常，MLT是分别测定需氧微生物总计数(TAMC)和酵母和霉菌总计数(TYMC)的方法。在生物负荷试验中，总活菌数(TVC)是作为一个整体来计算的。

生物负荷测试遵循USP(美国药典)60,61和62的指导方针。相比之下，MLT遵循USP 61和62的指导方针。

生物负荷和内毒素检测的区别

内毒素检测测定细菌内毒素，a磷脂在革兰氏阴性菌的外膜中发现的。相比之下，生物负荷不仅限于内毒素的测定，还扩展到细菌和真菌的计数。

生物负荷测试确定可活(活)微生物的总数。而内毒素检测则将不能存活的细菌视为死亡革兰氏阴性细菌释放内毒素。

内毒素检查通常在无菌和非热原设备中进行，通常直接或间接接触心血管、淋巴系统或脑脊液。同时，生物负荷测试有助于验证灭菌方法，并监测原材料、包装和环境。

生物负荷测试遵循USP(美国药典)60,61和62。但是内毒素检测遵循USP 161的指导方针。

内毒素测试不需要培养，因此一天内就能生成报告。同时，生物负荷检测需要培养，报告可能需要7至10天。

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生物负荷测试:目的、程序和可接受水平